Forskare från Max Planck Institute for the Science of Light i Erlangen har utvecklat en teknik för att direkt observera hur enzymer och andra biomolekyler gör sitt arbete, med potentiellt betydande medicinska och vetenskapliga fördelar. Genom att använda denna teknik, de har, för första gången med bara ljus och utan markör, observerade konformationsförändringar i DNA-polymeras, enzymet som ansvarar för replikering av DNA. Eftersom tekniken också kan användas för att studera hur enzymer fungerar, det skulle kunna hjälpa till att identifiera nya mekanismer för läkemedelsutveckling.

När biologer tittar genom ett modernt mikroskop, det de ser är lite som det du skulle kunna se om du skulle titta längs en motorväg på natten:fordon syns bara på deras strålkastare och det är omöjligt att avgöra om strålkastarna tillhör en bil eller en lastbil, eller om en parkerad bil öppnar dörren. För närvarande, Biologer kan bara observera enzymer som arbetar indirekt. De fäster fluorescerande färgämnen på enskilda komponenter i biomolekyler och tittar sedan på ljuspunkterna som rör sig under ett mikroskop. De kan se väldigt lite av hur enzymets form förändras. Dessutom, att ha en färgämnesmolekyl fäst vid det betyder att enzymet de tittar på inte är i sitt naturliga tillstånd. Det kan inte uteslutas att sådana färgämnesmolekyler kan påverka enzymets funktion.

Ett team av forskare under ledning av Frank Vollmer, tills nyligen ledare för en forskningsgrupp vid Max Planck Institute for the Science of Light och nu professor vid University of Exeter, har, dock, utvecklat en teknik för att göra det möjligt för dem att observera enzymer utan att fästa en fluorescerande markör.

En nanorod koncentrerar ljuset till ett område på bara några nanometer

Deras mikroskopiskt lilla instrument är faktiskt en sensor på en sensor. En guld nanorod runt 10 nanometer i diameter och 40 nanometer lång är fäst på en mikropärla av glas med en diameter på cirka 80 mikrometer (1 mikrometer =1/1000 millimeter). En ljusvåg, produceras av en laser, skickas skittrande runt insidan av denna mikropärla. Eftersom denna våg överlappar kanten på mikropärlan väldigt lite, den interagerar med den bifogade nanorod.

Denna interaktion börjar ganska svag, men mikropärlan fungerar som ett viskande galleri:I en rotunda, ett ord som viskade längs väggen hörs tydligt på andra sidan, eftersom ljudvågen följer väggens kurva snarare än att spridas åt alla håll. På samma sätt, ljusvågen som går runt och runt insidan av mikropärlan passerar guldnanorod tusentals gånger på extremt kort tid, förstärker interaktionen med nanorod.

Nanorod drar ut ljuset som överlappar kanten på mikropärlan ytterligare. Resultatet är ett koncentrerat ljusområde som en spotlight ungefär lika stor som staven, dvs bara några nanometer i diameter. Om ett enzym eller annan molekyl sedan binder till guldnanorod, det badar i detta strålkastarljus. Signalen som sensorn producerar beror på molekylen som är placerad i strålkastaren och hur den rör sig inom detta ljus. Detta gör det möjligt för forskarna att undersöka och registrera rörelserna hos en enda enzymmolekyl.

Olika signaler för olika enzymkonformationer

Tekniken är baserad på ett fenomen som kallas plasmonics. Appliceras på små metallstrukturer som nanorods, plasmonics gör att ljus kan koncentreras till ett område på bara några nanometer. "Detta tillåter oss att skala ner ljuset till storleken på ett enzym, " förklarar Frank Vollmer från Max Planck Institute for the Science of Light i Erlangen. Och ännu mer – forskarna i Erlangen har till och med lyckats använda sin teknik för att sondera enskilda joner.

I ett experiment, fysikerna fäste enzymet DNA-polymeras till sin sensor och försökte sedan registrera hur det rör sig. DNA-polymeras liknar en hand som greppar ett rör – röret är i detta fall den DNA-sträng som den bearbetar. Denna "hand" ger en annan signal när den är öppen och när den är stängd, eftersom detta ändrar storleken på överlappningen mellan ljusfläcken och enzymet. Detta har gjort det möjligt för forskarna att registrera hur enzymet öppnar och stänger i realtid. "Ytterligare förfining av vår teknik borde göra det möjligt för oss att göra saker som att direkt registrera syntesen av en DNA-sträng av polymerasenzymet, " förklarar Vollmer. Biokemister skulle då kunna observera i realtid hur enzymet kopierar genetisk information och till och med använda signalen som produceras av nanosensorn för DNA-sekvensering.

Experiment med den nya tekniken har kunnat observera mer än bara hur enzymer rör sig. "Vi har använt det för att observera temperaturberoendet av enzymaktivitet, " förklarar Frank Vollmer. Detta erbjuder ett enkelt sätt att utföra termodynamiska studier. Sådana studier kan ge information om egenskaper som aktiveringsenergin hos ett enzym, förklarar fysikern. Aktiveringsenergin är ett mått på effektiviteten hos dessa biologiska katalysatorer.

Nanosensorn kan användas för att observera kemiska reaktioner

För att visa hur små partiklarna som kan detekteras med en plasmonisk nanosensor kan vara, forskarna använde den för att observera enskilda joner (elektriskt laddade atomer). "Vi blev förvånade över att detta ens var möjligt, " säger Vollmer. Zink- och kvicksilverjonerna de använde är bara cirka en tiondels nanometer stora – mindre än en tusendel av våglängden på det använda ljuset. Det är, dock, möjligt att producera en ljus fläck i änden av en nanorod som kan sondera så små dimensioner. "Det handlar inte om att identifiera enskilda joner, " betonar Vollmer. Forskarna kunde säkerställa att exakt en jon fäste sig vid änden av nanorod genom att variera koncentrationen av joner i lösningen. Att komma ner till denna skala skulle kunna göra det möjligt för biologer att studera jonkanalsfunktion. Jonkanaler inkluderar, till exempel, proteiner inbäddade i nervcellsmembran som är ansvariga för signalöverföring längs nerven.

Användningen av nanosensorn som utvecklats av Frank Vollmers team är inte begränsad till att visualisera biokemiska processer som involverar enzymer och andra proteiner. Den kan också användas för att observera kemiska reaktioner mellan enskilda molekyler och ytan på guldnanorod. "Med den här tekniken, vi kan, till exempel, upptäcka och analysera interaktionsmekanismer, " förklarar Frank Vollmer. Tidsförloppet för dessa interaktioner kan ge insikter i hur olika molekyler binder till ytan av guldnanorod.

För att visa detta, forskarna studerade två typer av molekyler, en som innehåller en amingrupp, en innehållande en tiolgrupp. "Det visar sig att de två grupperna reagerar med guldets yta via olika mekanismer, " förklarar Vollmer. Medan amingrupperna binder till guldatomer som sticker ut från ytan, tiolgrupperna binder endast till atomer som är helt inbäddade i ytan.

Forskarna observerade också reaktioner mellan de olika molekylerna. "Detta tillåter kemister att testa och optimera reaktionsförhållandena i realtid, " säger Vollmer. Användningen av denna guld nanorod ljusfläck är inte begränsad till att studera kemiska reaktioner, men – den kan också användas för att kontrollera dem. Genom att öka intensiteten av ljuset i den koncentrerade ljuspunkten, forskarna gjorde det möjligt för en kvicksilverjon att binda till ytan av guldnanorod. Intensiteten av ljuset i ljusfläcken ökar energin hos elektronerna i guldstaven så att de kan reagera med kvicksilverjonerna. Detta ger ett stabilt amalgam av guld och kvicksilver. De två elementen förblir sammanslagna även när ljusfläcken försvinner, eftersom reaktionen ger en relativt stabil kovalent bindning mellan en guldatom och en kvicksilveratom.

"Att kontrollera reaktioner och enzymaktivitet på den plasmoniska biosensorn är ett mycket intressant område för framtida forskning, " säger Vollmer. Ljuspunkten kan också användas som en optisk pincett för att tillfälligt fixera enskilda biomolekyler till sensorn för optisk analys.

Insikter om funktionsfel i livets maskineri

Vollmers teams framtidsvision är att kunna skanna molekyler – både biomolekyler och syntetiska molekyler – atom för atom. "Genom att använda olika ljuskällor med olika våglängder och polarisationer, det är i princip möjligt att modifiera i vilken grad ljuset överlappar molekylen och undersöka olika domäner av samma molekyl, " förklarar Vollmer. En molekylär skanner av den här typen kanske kan observera en process från en mängd olika vinklar och med mycket korta intervall. En högupplöst karta över en sådan process skulle avsevärt förbättra vår förståelse av det molekylära maskineriet. Biologer skulle till och med kunna observera i detalj hur sådana strukturer förändras över perioder som sträcker sig från nanosekunder till flera timmar.Den plasmoniska biosensorn ökar också möjligheten för ett automatiserat laboratorium som inte är större än en fingernagel, som skannar ett prov, protein för protein, att diagnostisera sjukdom på molekylär nivå.

Skulle det i framtiden bli möjligt att använda plasmoniska nanosensorer för att se hur enzymer ändrar form, detta skulle kunna göra det möjligt för läkare att bättre förstå hur funktionsfel i livets maskineri orsakar sjukdomar som Alzheimers, som är förknippade med förändringar i enzymstruktur. En bättre förståelse för sådana processer skulle till och med kunna ge nya metoder för behandling.