• Home
  • Kemi
  • Astronomien
  • Energi
  • Naturen
  • Biologi
  • Fysik
  • Elektronik
  •  science >> Vetenskap >  >> Kemi
    Måla den molekylära duken i superupplösning

    Teamet demonstrerade funktionerna hos Action-PAINT på syntetiska DNA-nanostrukturer som exponerar identiska närliggande dockningsplatser för imagersträngar. I ett första steg visualiserades dockningsplatserna med superupplösningsmikroskopi (vänster), sedan, med hjälp av ett speciellt mjukvarupaket, manuellt utvalda individuella dockningsplatser märktes genom att tvärlänka imager-strängarna till dem med UV-strålning (mitten), och slutligen, framgångsrika märkningshändelser verifierades med en extra omgång av superupplösningsmikroskopi (höger). Kredit:Wyss Institute vid Harvard University

    För att förstå hur enskilda molekyler spelar sin roll i biologiska processer inuti cellerna de syntetiseras i, forskare har utvecklat superupplösningsmikroskopimetoder för att visualisera dem på singelmolekylnivå. Dock, att undersöka deras funktioner, i sista hand, de skulle också vilja kunna modifiera dem individuellt med denna höga upplösning. Medan visualiseringen av enstaka molekyler har gjort stora framsteg de senaste åren, hittills har det varit utmanande att direkt modifiera dem i en kontrollerad, molekyl-till-molekyl-mode.

    Nu, redovisas i Naturkemi , forskare vid Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering och Harvard Medical School (HMS), har utvecklat "Action-PAINT, " en metod som kombinerar teamets DNA-PAINT superupplösningsmikroskopi i realtid med en strategi för märkning av en enda molekyl på en önskad plats inom syntetiska nanostrukturer eller intakta celler. Detta tillvägagångssätt skulle kunna utvecklas vidare för att tillåta forskare att stimulera eller hämma funktioner hos enskilda molekyler och studera konsekvenserna för normala biologiska och sjukdomsrelaterade processer i realtid och superupplösning.

    "Superupplösta bildbehandlingsmetoder har gjort det möjligt för oss att "se det tidigare osynliga." Genom att koppla vår DNA-PAINT superupplösningsmikroskopimetod med ett tvärbindande tillvägagångssätt, vi kan nu också 'röra det tidigare otillgängliga' genom att fästa ett fysiskt handtag på individuellt observerbara molekyler precis vid tidpunkten för visualisering, " sa Wyss Institute Core Faculty-medlem Peng Yin, Ph.D., som ledde studien. Yin är också en medledare för institutets Molecular Robotics Initiative, och professor i systembiologi vid HMS.

    Yins team utvecklade en tvåstegsmetod som först visualiserar enstaka proteiner eller andra molekyler i superupplösning, och överför sedan en molekylär märkning till det önskade målstället. Valfritt, forskarna kan bekräfta framgångsrika överföringar med en extra omgång av superupplöst bildbehandling.

    Det första steget i en molekylavbildning bygger på DNA-PAINT-metoden som gjorde det möjligt för teamet att först bestämma den exakta lokaliseringen av molekyler eller molekylära egenskaper som är rumsligt åtskilda av avstånd långt under ljusets diffraktionsgräns, och därför osynlig för de flesta mikroskop. Forskarna fäste först en kort "dockningssträng" av DNA till målet som fungerar som ett bindningsställe för en komplementär "imager-sträng" som bär ett fluorescerande färgämne. Eftersom imager-strängen binder med en programmerbar på/av-hastighet, den producerar definierade "blinkande" händelser som kan observeras med hjälp av standardmikroskop. För att fästa en fysisk etikett på målet, forskarna genomförde sitt första superupplösningsavbildningssteg med en något mer komplex bildsträng som också inkluderade en fotoinducerbar tvärbindare, som kemiskt kan koppla docknings- och bildskärmssträng till varandra när de utsätts för UV-strålning, och en ytterligare reportersekvens.

    För att märka individuella proteinmål i intakta celler med Action-PAINT, dockningssträngar är fästa till antikroppsmolekyler som binder till målproteiner med hög specificitet. Alla antikroppsbindningshändelser vid målproteiner i ett definierat område visualiseras med komplementära fluorescerande bildsträngar med superupplösningsmikroskopi (vänster), och målproteiner i handplockade områden som visas som gröna fyrkanter (mitten) är märkta av tvärbindningshändelser. Till sist, framgångsrika tvärbindningshändelser bekräftas med hjälp av sekundära bildskärmssträngar och superupplösningsavbildning (höger). Kredit:Wyss Institute vid Harvard University

    "En kritisk komponent i vår nya metod är den exakta kontrollen av tvärbindningslasern, som fungerar synkront med den superupplösta blinksekvensen. Detta omvandlar verkligen vår DNA-PAINT superupplösningsmikroskopi från en passiv avbildningsmetod till en aktiv, möjliggör interaktion i realtid mellan forskaren och individuella molekylära mål, " sa medförsta och medkorsande författaren Mingjie Dai.

    För att aktivera denna nya förmåga, teamet utvecklade ett mjukvarupaket som gjorde det möjligt för dem att först kartlägga de exakta platserna för alla molekylära mål i ett område av intresse med hjälp av DNA-PAINT-metoden, och synkronisera sedan blinkningen av en UV med efterföljande blinkande händelser. "På detta sätt kunde vi kemiskt binda avbildningssträngen till specialutvalda molekylära mål, en och en, med molekylär upplösning - som en målare lägger ner sin färg, lapp för lapp i pointillismstil, sa Dai, Ph.D., en tidigare postdoktor i Yins team, som för närvarande är avdelningsstipendiat vid HMS avdelning för systembiologi och teknikutvecklingsstipendiat vid Wyss Institute.

    För att visa effektiviteten och selektiviteten i deras tillvägagångssätt, teamet använde först syntetiska DNA-nanostrukturer som exponerade dockningsplatser för imagersträngar i definierade mönster. "Att sätta Action-PAINT i arbete, vi började med att demonstrera dess effektivitet med att märka mål för enstaka molekyler på bara 30 till 70 nm avstånd från sina identiska grannar med hög effektivitet på målet, " sa medförfattaren Ninning Liu, Ph.D., "och sedan ytterligare validerat vår metod i fixerade celler, där vi valde och märkte mikrotubuliproteiner längs cytoskelettfilament, med olika specialdefinierade mönster." Liu är en postdoktor i Yins team.

    Författarna föreställer sig att Action-PAINT skulle kunna vidareutvecklas till ett brett tillämpbart verktyg som, till exempel, kan hjälpa till att direkt modifiera aktiviteten hos enmembranreceptorer på cellytan där de styr cellbeteendet, eller av jonkanaler som styr neuronala cellers funktion. Dessutom, metoderna skulle kunna tillåta överföring av molekylära handtag till enstaka proteiner som kan tillåta deras extraktion och rening tillsammans med andra proteiner de binder till naturligt.

    "Action-PAINT lägger till ytterligare en nivå av funktionalitet till de funktioner som utvecklats av Peng Yins team som kan möjliggöra både molekylär positionsbaserad funktionell proteininteraktionskartläggning inuti individuella celler, och biokemisk analys av dessa interaktioner när dessa molekyler väl är isolerade, som i framtiden kan hjälpa till att identifiera och/eller validera nya läkemedelsmål, " sa Wyss Institutes grundare Donald Ingber, M.D., Ph.D.


    © Vetenskap https://sv.scienceaq.com