• Home
  • Kemi
  • Astronomien
  • Energi
  • Naturen
  • Biologi
  • Fysik
  • Elektronik
  • Att höja vätskeväggar runt levande celler

    Omkonfigurera mönster i vätskeväggarna. Se hela filmen på, Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aav8002

    Cellodlingsplattor som är i daglig användning inom biologi kan effektivt omvandlas till mikrofluidiska enheter, öppna banor för biologer för att minimera cellbaserade arbetsflöden. I en ny rapport, Ph.D. forskaren Cristian Soitu och medarbetare vid avdelningarna för ingenjörsvetenskap och patologi vid University of Oxford, Oxford, STORBRITANNIEN., beskrev en enkel metod för att skapa mikrofluidiska arrangemang runt celler. I studien, cellerna växte redan på vanliga petriskålsytor, när forskarna använde gränssnittet mellan de icke -blandbara vätskemedierna i behållaren som byggmaterial.

    De omformade de konventionella cellodlingsskålarna till sofistikerade mikrofluidiska enheter på begäran genom att omforma vätskestrukturer runt levande celler. Soitu beskriver den nya vätskeformningstekniken byggd av hans forskargrupp som "vätskestrukturer för de celler med rädsla för engagemang när de väljer ett hem - de kan lätt tas bort och nya (med en annan geometri) byggas på plats." Forskningen publiceras nu på Vetenskapens framsteg

    Forskarna demonstrerade metoden med hjälp av arbetsflöden som involverar cellkloning; selektiv kloning av en specifik klon från bland annat en skål; läkemedelsbehandlingar; och sårläkning. Forskningsarbetet visade ett mångsidigt tillvägagångssätt, kopplat till biologiskt vänliga funktioner för att främja mikrofluidik -tekniken bland biologer. Mikrofluidikbaserade metoder har vunnit popularitet i många arbetsflöden, även om deras upptag i vanlig biologi förblir långsamt på grund av en mängd olika bidragande orsaker, Inklusive:

    1. Materialinkompatibilitet för celltillväxt
    2. Mikrofluidiska arkitekturer som är inneslutna och otillgängliga
    3. Förutbestämda geometrier som inte kan omkonfigureras under experiment - vilket orsakar tillverkningskostnader och drift
    4. Arbetsflöden utformade av ingenjörer som inte anpassar sig till redan existerande tekniker som utvecklats av biologer.

    Förr, forskare skapade 3D-konstruktioner med vätskeväggar i nanoskala, även om deras biokompatibilitet återstår att bedöma. I det nuvarande arbetet, därför, Soitu et al. utvecklat en metod för att göra matriser av isolerade mikrofluidkammare på jungfruliga petriskålar för att rymma stora arbetsflöden inom cellbiologi. Möjliga exempel inkluderar cellmatning och överföring, kloning, kryokonservering, fixering och immunmärkning, cellys och omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (RT-PCR) och CRISPR-Cas9 genredigering. I tidigare experiment med sådana arbetsflöden lade forskare till cellerna efter tillverkning av mikrofluidik.

    I det nuvarande arbetet, forskarna skapade en mängd olika mikrofluidiska arrangemang på vanliga petriskålar som innehåller vidhäftande celler och omkonfigurerade dem i realtid. De isolerade och hämtade cellkloner för att utföra proof-of-concept drogtester och sårläkningsanalyser och introducerade den nya tekniken för att skapa och omkonfigurera mikrofluidiska kretsar på petriskålar medan cellerna växte och delade sig, med många potentiella tillämpningar inom mainstream biologi.

    UPP:Kammarkonstruktion. (A) Princip. Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) + 10 % fetalt bovint serum (FBS) tillsätts till en jungfrulig petriskål, och det mesta av mediet avlägsnas för att lämna en tunn film som täcker botten, som överlagras med FC40. Pennan flyttas över botten för att skapa ett mikrofluidiskt arrangemang. När det är klart, den initiala volymen av DMEM + 10 % FBS kommer att delas i två delar åtskilda av en kontinuerlig vätskevägg av FC40 fäst vid substratet. (B) Olika mönster. (a) Genom att skapa vertikala och horisontella linjer med lika avstånd skapas en array (32 × 32; 1 mm avstånd). Nästa, 60 nl blått färgämne tillsätts av skrivaren till utvalda kamrar; perifera kammare får blå färg för att ge den blå fyrkanten, och interna ger ordet "OXFORD." Förstoringen (höger) visar enskilda kammare utan och med färgämne. (b) Ett liknande mönster skapas genom att forma två rutor (en något större än den andra) med pennan och sedan lägga till färg manuellt i utrymmet däremellan; varje bokstav görs genom att forma dess sidor och igen fylla insidan manuellt. Förstoringen visar att bokstaven "F" är en kontinuerlig vätskekropp. Foto:Cristian Soitu, Oxfords universitet. NEDERST:Konfigurera om mikrofluidarrangemang. Bilder visar ramar från filmen. (1) Ett initialmönster skrivs ut:en cirkel (radie, 1,5 mm) inuti en triangel (sida, 7 mm) inuti en kvadrat (sida, 9 mm). (2 till 4) Olika färgämnen läggs till i varje fack (1,5 | il rött färgämne, 1,5 μl gult färgämne, och 5 μl blått färgämne); färgämnen är begränsade inom FC40 -väggar. (5) Mer gult färgämne läggs till i cirkeln. (6) Efter att ha tillsatt 3 μl gult färgämne, den cirkulära fästlinjen brister och innehållet rinner ut i triangeln. (7) Efter tillsats av 24 μl, den triangulära fästlinjen brister och innehållet rinner ut på torget. (8) Sextio mikroliter tas ut från torget. (9) Ett nytt mönster skrivs ut - en triangel (sida, 4,5 mm) i en cirkel (radie, 3,3 mm) - på den inledande rutan. (10 till 12) Färgade färgämnen läggs till de tre olika facken som tidigare. Fotokredit:Cristian Soitu, Oxfords universitet. Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aav8002

    Den nya tekniken och proof-of-concept-experimenten

    I de experiment som följde, forskarna täckte först botten av en petriskål med vävnadsodlingsmedium och tog bort det mesta av mediet för att bilda en tunn film som täcker polystyrensubstratet. De täckte den tunna filmen med ett oblandbart fluorkolväte (FC40) för att förhindra avdunstning och som en barriär mot externa föroreningar för att bibehålla steriliteten hos mediet. Använd sedan en teflon -spets, forskarna kontaktade botten av skålen, ersätta vattenfasen för att bilda mikrofluidiska arrangemang i form av intresse - i detta fall, en ruta. Med hjälp av tekniken, forskarna förde den öppna mikrofluidiska plattformens fördelar till vanliga cellodlingsprodukter.

    Soitu et al. formade vattenfasen för att skapa ett rutnät med små volymer vätska som tidigare demonstrerats av samma team, och betraktade dem med selektiva färgämnen i selektiva kammare. Till exempel, perifera kammare fick ett blått färgämne (bildar en blå kvadrat) och de i det inre bildade ordet "OXFORD".

    Skapa kammare för isolering av cellkloner. Se hela filmen på, Upphovsman:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aav8002

    Forskarna "tryckte ut" en cirkel i en triangel i en kvadrat och använde mikroliter av tre färgämnen för att se de tre formerna separat; där FC40 hindrade färgämnena från att blandas. Resultaten visade förmåga att bygga och förstöra FC40-väggar för att effektivt begränsa vätskorna i önskad 2-D-form.

    Efter de preliminära proof-of-concept-resultaten, Soitu et al. genererade uppsättningar av kammare för att rekapitulera kloningen av tumörceller från musbröst (NM18), som de ursprungligen skapade rutnät för, följt av celladdition därefter. Forskarna tillät först cellerna att växa fritt omgivna av FC40 -väggen som är genomsläpplig för båda O 2 och CO 2 , och sedan genom att odla enstaka celler till kloner innan de omger dem med vätskeväggar av olika former.

    De visade att vätskeväggar med olika 2-D-fotavtryck enkelt kunde byggas runt levande celler, så länge som kolonierna förblev isolerade från varandra under efterföljande behandling eller hämtning. Tidigare studier som växte celler inom begränsade, förmönstrade ytor krävde ytbehandling före cellvidhäftning - vilket bidrog till det anmärkningsvärda undantaget i föreliggande teknik.

    Applikationer inom klonplockning och drogtester

    VÄNSTER:Halvautomatisk selektiv klonplockning (HEK-celler). Skrivaren lägger till/tar bort en mikroliter till/från kamrarna i olika steg. (A) Tillvägagångssätt. (a) Platser på en "referensplatta" av glas är markerade med unika identifierare (dvs. A1, A2 …, B1 ...). (b) En 6 cm skål med kolonier (röd) placeras på referensplattan. (c) Efter att ha spelat in koloniala platser och matat in dem i ett skript, vätskeväggar trycks runt utvalda kloner (svarta linjer). (d) Kloner hämtas från dessa kamrar. (B) Isolering av en klon. HEK -celler plattades ut med låg densitet (~ 1 cell/cm2) och odlades (8 dagar) till kloner, skålen placerades på en referensplatta, och väggar byggdes runt utvalda kloner. Tre olika z-axelvyer av en klon visas. (a) Referensskylt med unika identifierare i fokus. (b) Koloni i fokus (identifierare ur fokus) med förstoring. (c) Koloni efter att ha byggt omgivande murar. (C) Klonplockning. (a) Fyrkantig mur byggd runt en levande koloni. Skrivaren tvättar cellerna genom att lägga till/hämta 1 μl PBS; den tillsätter sedan 1 μl trypsin. (b) skålen inkuberas (37 ° C; 5 min) för att lossa celler från ytan, och skrivaren hämtar 1 | il innehållande den cellrika suspensionen (och överför den till ett mikrocentrifugrör) för att lämna den nu tomma kammaren. (c) Uttagna celler stryks ut manuellt i en mikrotiterplatta med 12 brunnar och odlas på konventionellt sätt under 5 dagar; celler fäster och växer. HÖGER:Två läkemedelsbehandlingar sida vid sida med obehandlade celler. Vätska väggar byggdes runt HEK -celler (300, 000 celler; 6 cm skål) odlas i 24 timmar. (A) Puromycin (3 × 3 rutnät; 2 mm × 2 mm kamrar). Skrivaren lägger till 1 μl medium till den centrala kammaren och 1 μl medium + puromycin till perifera (slutkoncentration, 10 μg/ml), enligt tecknad film. Cellviabiliteten bedöms efter inkubation (37 °; 24 timmar) med användning av en trypanblå uteslutningsanalys. Celler i ytterkammare är döda (mer än 60% i var och en), medan de i den centrala förblir vid liv (mindre än 5% celldöd). Denna analys har replikerats tre gånger. (B) TNF-a. Par av kammare med distinkta former är tryckta, det ena som omger det andra. Skrivaren tillsätter 0,5 μl medium ± TNF-α (slutkoncentration, 10 ng/ml) till en eller annan volym (som i tecknade serier). När celler kodar för en GFP-reportergen som styrs av en promotor påslagen av TNF-α, de fluorescerar grönt vid exponering för cytokinet. Fluorescensbilder visar att endast celler i den behandlade volymen fluorescerar grönt. Volympar hade följande dimensioner:(a) kvadrat (sida, 1,8 mm) i cirkel (radie, 1,75 mm); (b) triangel (sida, 1 mm) i kvadrat (sida, 3,5 mm); (c) cirkel (radie, 1 mm) i kvadrat (sida, 3,5 mm). Upphovsman:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aav8002

    I nästa steg, forskarna skapade en referensplatta på vilken de placerade en skål med levande cellkolonier av intresse för att isolera cellkloner av intresse från andra genom att trycka vätskeväggar runt dem. På isolering, de kunde välja kolonierna, återvinna cellerna och odla dem på konventionellt sätt för att föröka sig som förväntat. Eftersom vätskeväggarna effektivt kunde begränsa vätskorna, Soitu et al. testade deras effektivitet genom att lägga till puromycin – en liten molekylöversättarhämmare som dödar däggdjursceller.

    I experimentuppställningen för läkemedelsscreening, de tillät centralkammaren att ta emot tillväxtmedium ensam, medan läkemedlet levererades till de omgivande kamrarna i en hög dödlig dos, för att visa effekten av FC40 -separation när endast cellinjerna i den centrala kammaren överlevde. I ett andra exempel, Soitu et al. utnyttjade egenskapen hos en mänsklig embryonisk njurcellinje genetiskt modifierad för att koda en grön fluorescerande promotorgen. Som slog på i närvaro av tumörnekrosfaktor-α för att fluorescera grönt. Vätskeväggarna bildade effektiva barriärer mot läkemedelsexponering, verifiera teknikens läkemedelsscreeningspotential.

    Tillämpningar vid sårläkning

    En proof-of-concept sårläkningsanalys med en skål förbelagd med Matrigel och fibronektin i olika regioner. (A) Tecknad illustrerande arbetsflöde. (a) Ett tunt lager av medium täcks med FC40. (b) Två kammare (3 mm × 4 mm vardera) är tryckta sida vid sida. (c) Ytor i kammare är belagda med Matrigel eller fibronektin (2 | il; slutkoncentration på 1 | ig/cm2; 1 timme); insatsen visar en bild av en kammare. Vätska väggar förstörs nu, och skålen tvättas med 3 ml medium för att avlägsna obefogade beläggningar. (d) HEK-celler (600, 000) pläteras i skålen. (e) Efter 24 timmar, celler har bildat ett monoskikt, och ett sår (0,4 mm × 2 mm) skapas genom att skrapa pennan över ytan för att avlägsna celler i dess väg. Läkningen av såret övervakas nu mikroskopiskt. (B och C) Bilder av sår i monolager odlade på Matrigel eller fibronektin. (a och b) Omedelbart före och efter skador (några droppar av FC40 finns kvar där väggarna ursprungligen stod). (c) Efter 24 timmar, celltillväxt minskar sårbredderna till <0,2 mm och <0,15 mm med Matrigel och fibronektin, respektive. (d) Senast 48 timmar, såren har läkt helt. Upphovsman:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aav8002

    De genomförde också proof-of-principe sårläkningsanalyser genom att använda en enda skål belagd på två olika sätt, för att övervaka två sårläkningstillstånd. För detta, forskarna använde Matrigel - ett gelatinöst protein som utsöndras av sarkomceller och fibronektin - ett glykoprotein i den extracellulära matrisen som förbättrade sårläkning. De lade till HEK-celler som bildade ett monolager i skålarna och skapade ett "sår" genom att dra Teflon-spetsen över monolagret när celler migrerade in i såren i något olika hastigheter. Även om i detta arbetsflöde Soitu et al. ytbelagd ytan innan du pläterar celler, de kan också modifiera beläggningstekniken för dess tillsats efter att cellerna börjat migrera in i de nybildade såren för att främja läkning.

    På det här sättet, Cristian Soitu och medarbetare utvecklade en flexibel, mikrofluidisk plattform för att minimera arbetsflöden inom cellbiologi. De utökade tekniken i det föreliggande arbetet för att bilda mikrofluidiska arrangemang runt förpläterade vidhäftande celler följt av en mängd olika principer för analys av cellkloning, läkemedelsscreening och sårläkning. Plattformen har många fördelar och kan ersätta det konventionella läget för förkonstruerade mikrofluidiska enheter som ett flexibelt och anpassningsbart alternativ. De nya mikrofluidarrangemangen är kostnadseffektiva och bidrar till sparsam vetenskap och kan konfigureras om i realtid under ett experiment för ökad mångsidighet. Forskarna noterar teknikens begränsningar, inklusive 2-D-begränsade arrangemang och bräckligheten hos vätskeväggar jämfört med fasta väggar. Soitu et al. hoppas kunna optimera och kombinera dessa funktioner och fördelar för att ge en ny plattform för vanliga biologer att utforska kraften i mikrofluidik.

    © 2019 Science X Network




    © Vetenskap https://sv.scienceaq.com