MIT-forskare har utvecklat ett sätt att göra extremt högupplösta bilder av vävnadsprover, till en bråkdel av kostnaden för andra tekniker som erbjuder liknande upplösning.

Den nya tekniken bygger på expanderande vävnad innan den avbildas med ett konventionellt ljusmikroskop. Två år sedan, MIT-teamet visade att det var möjligt att expandera vävnadsvolymer 100 gånger, vilket resulterar i en bildupplösning på cirka 60 nanometer. Nu, forskarna har visat att utvidgning av vävnaden en andra gång innan avbildning kan öka upplösningen till cirka 25 nanometer.

Denna upplösning gör att forskare kan se, till exempel, proteinerna som samlas i komplexa mönster vid hjärnans synapser, hjälpa neuroner att kommunicera med varandra. Det kan också hjälpa forskare att kartlägga neurala kretsar, säger Ed Boyden, docent i biologisk teknik och hjärn- och kognitiv vetenskap vid MIT.

"Vi vill kunna spåra kablarna för kompletta hjärnkretsar, säger Boyden, studiens seniorförfattare. "Om du kunde rekonstruera en komplett hjärnkrets, kanske du kan göra en beräkningsmodell för hur det genererar komplexa fenomen som beslut och känslor. Eftersom du kan kartlägga de biomolekyler som genererar elektriska pulser i celler och som utbyter kemikalier mellan celler, du kan eventuellt modellera hjärnans dynamik. "

Detta tillvägagångssätt kan också användas för att avbilda andra fenomen som interaktioner mellan cancerceller och immunceller, att upptäcka patogener utan dyr utrustning, och för att kartlägga celltyperna i kroppen.

Tidigare MIT postdoc Jae-Byum Chang är den första författaren till tidningen, som visas i 17 april -numret av Naturmetoder .

Dubbel expansion

För att expandera vävnadsprover, forskarna bäddar in dem i en tät, jämnt genererad gel av polyakrylat, ett mycket absorberande material som också används i blöjor. Innan gelen bildas, forskarna märker de cellproteiner de vill bilda, med hjälp av antikroppar som binder till specifika mål. Dessa antikroppar har "streckkoder" gjorda av DNA, som i sin tur är bundna till tvärbindande molekyler som binder till polymererna som utgör den expanderbara gelén. Forskarna bryter sedan ner proteinerna som normalt håller ihop vävnaden, låta DNA -streckkoderna expandera bort från varandra när gelen sväller.

Dessa förstorade prover kan sedan märkas med fluorescerande sonder som binder DNA -streckkoderna, och avbildad med kommersiellt tillgängliga konfokalmikroskop, vars upplösning vanligtvis är begränsad till hundratals nanometer.

Med den metoden, forskarna kunde tidigare uppnå en upplösning på cirka 60 nanometer. Dock, "enskilda biomolekyler är mycket mindre än så, säg 5 nanometer eller ännu mindre, "Boyden säger." De ursprungliga versionerna av expansionsmikroskopi var användbara för många vetenskapliga frågor men kunde inte jämföra prestanda för de högupplösta avbildningsmetoderna som elektronmikroskopi. "

I sin ursprungliga expansionsmikroskopistudie, forskarna fann att de kunde expandera vävnaden mer än 100-faldigt i volym genom att minska antalet tvärbindande molekyler som håller polymeren i ett ordnat mönster. Dock, detta gjorde vävnaden instabil.

"Om du minskar tvärbindningstätheten, polymererna behåller inte längre sin organisation under expansionsprocessen, säger Boyden, som är medlem i MIT:s Media Lab och McGovern Institute for Brain Research. "Du tappar informationen."

Istället, i deras senaste studie, forskarna modifierade sin teknik så att efter den första vävnadsexpansionen, de kan skapa en ny gel som sväller vävnaden en andra gång - ett tillvägagångssätt som de kallar "iterativ expansion".

Kartläggningskretsar

Med iterativ expansion, forskarna kunde avbilda vävnader med en upplösning på cirka 25 nanometer, som liknar den som uppnås med högupplösta tekniker, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM). Dock, expansionsmikroskopi är mycket billigare och enklare att utföra eftersom ingen specialutrustning eller kemikalier krävs, Säger Boyden. Metoden är också mycket snabbare och därmed kompatibel med storskaliga, 3D-avbildning.

Upplösningen för expansionsmikroskopi överensstämmer ännu inte med skanningselektronmikroskopi (cirka 5 nanometer) eller transmissionselektronmikroskopi (cirka 1 nanometer). Dock, elektronmikroskop är mycket dyra och inte allmänt tillgängliga, och med dessa mikroskop, det är svårt för forskare att märka specifika proteiner.

I Naturmetoder papper, MIT -teamet använde iterativ expansion till bildsynapser - förbindelserna mellan neuroner som gör att de kan kommunicera med varandra. I sin ursprungliga expansionsmikroskopistudie, forskarna kunde avbilda byggnadsställande proteiner, som hjälper till att organisera hundratals andra proteiner som finns i synapser. Med det nya, förbättrad upplösning, forskarna kunde också se strukturer i finare skala, såsom placeringen av neurotransmittorreceptorer belägna på ytorna av de "postsynaptiska" cellerna på den mottagande sidan av synapsen.

"Min förhoppning är att vi kan under de kommande åren, verkligen börja kartlägga organisationen av dessa ställnings- och signalproteiner vid synapsen, Säger Boyden.

Att kombinera expansionsmikroskopi med ett nytt verktyg som kallas temporal multiplexing bör hjälpa till att uppnå det, han tror. För närvarande, endast ett begränsat antal färgade sonder kan användas för att avbilda olika molekyler i ett vävnadsprov. Med temporal multiplexing, forskare kan märka en molekyl med en fluorescerande sond, ta en bild, och tvätta sedan bort sonden. Detta kan sedan upprepas många gånger, varje gång med samma färger för att märka olika molekyler.

"Genom att kombinera iterativ expansion med temporal multiplexing, vi skulle i princip kunna ha i princip oändlig färg, nanoskala-upplösning över stora 3D-volymer, "Säger Boyden." Det börjar bli riktigt spännande nu när dessa olika tekniker snart kan komma i kontakt med varandra. "

Forskarna hoppas också kunna uppnå en tredje expansionsrunda, som de tror kan, i princip, möjliggöra upplösning på cirka 5 nanometer. Dock, just nu begränsas upplösningen av storleken på antikropparna som används för att märka molekyler i cellen. Dessa antikroppar är cirka 10 till 20 nanometer långa, så för att få upplösning under det, forskare skulle behöva skapa mindre taggar eller expandera proteinerna från varandra först och sedan leverera antikropparna efter expansion.