En forskargrupp ledd av Kobe Universitys professor MATOBA Osamu (Organisation for Advanced and Integrated Research) har framgångsrikt skapat 3D-fluorescens och fasavbildning av levande celler baserat på digital holografi. De använde växtceller med fluorescerande proteinmarkörer i sina kärnor för att demonstrera detta bildsystem.

Gruppen bestod av projektassistent Manoj KUMAR och biträdande professor Xiangyu QUAN (båda från Graduate School of System Informatics), Professor AWATSUJI Yasuhiro (Kyoto Institute of Technology) och docent TAMADA Yosuke (Utsunomiya University).

Denna teknik kommer att utgöra en grund för levande cellavbildning, vilket är oumbärligt inom biovetenskapsområdet. Det förväntas också att användningen av denna teknik för att visualisera stamcellsprocesser i växter kommer att öka vår förståelse för dem.

Dessa forskningsresultat publicerades i tidskriften Vetenskapliga rapporter , publicerad av Springer Nature den 15 maj.

Forskningsbakgrund

Det optiska mikroskopet uppfanns i slutet av 1500-talet och den brittiske vetenskapsmannen Robert Hooke var den första att upptäcka celler i mitten av 1600-talet. Uppfinningen har utvecklats till nya teknologier som faskontrastmikroskopet (1953 Nobelpriset i fysik), som gör att levande celler kan observeras utan att de behöver färgas, och fluorescerande cellulär avbildning, där specifika molekyler märks med fluorescerande proteiner (2008 års Nobelpris i kemi) och observeras i levande celler. Dessa har blivit viktiga verktyg för observation inom biovetenskap och medicinska områden.

Fasavbildning använder skillnaden i ljusets optiska längd när det passerar genom ett biologiskt prov för att avslöja strukturell information om det. Fluorescensavbildning ger information om specifika molekyler inuti det biologiska provet, och kan avslöja deras funktioner. Dock, den intracellulära strukturen och rörligheten är komplexa. Förmågan att visualisera multidimensionell fysisk information innefattande fas- och fluorescensavbildning skulle vara användbar för att förstå dessa aspekter. Ett avbildningssystem som kan generera varierad fysisk information samtidigt och omedelbart från 3-D levande celler skulle fungera som en grundteknologi för att åstadkomma innovation inom biologi.

Det hybrida multimodala avbildningssystemet som konstruerats i denna studie kan erhålla fas- och fluorescerande 3D-information i ett enda skott. Det gör det möjligt för forskare att kvantitativt och samtidigt visualisera ett biologiskt provs strukturella eller funktionella information med hjälp av en enda plattform.

Forskningsmetodik

I den här studien, forskarna konstruerade ett multimodalt digitalt holografiskt mikroskop som kunde registrera ett provs fluorescerande information och fasinformation samtidigt (Figur 1). Detta använder digital holografi som bas, varvid störd ljusinformation från objektet registreras och sedan optiska beräkningar gjorda av dator används för att generera 3-D rumslig information om objektet.

Mikroskopet i studien är sammansatt av två olika optiska system. För det första, det holografiska 3D-fluorescensbildsystemet, som visas på höger sida av figur 1. För att få 3D-fluorescensinformation, en rumslig ljusmodulator används för att dela det fluorescerande ljuset som emitteras från fluorescerande molekyler i två ljusvågor som kan störa varandra.

Vid denna tidpunkt, 3D-informationen från objektljuset bevaras genom att ge en av ljusvågorna en något annorlunda krökningsradie och utbredningsriktning; på samma gång, de två ljusvågorna är på en delad optisk väg (för det mesta längs samma axel) vilket möjliggör en tidsmässigt stabil interferensmätning. Detta optiska system formulerades i denna studie, klargör den registrerade störningsintensitetsfördelningen för första gången. Denna formel gjorde det möjligt för forskarna att hitta experimentella förhållanden som skulle förbättra kvaliteten på de rekonstruerade fluorescerande bilderna. De kunde generera tredimensionella bilder av levande celler och deras strukturer genom att applicera detta fluorescerande 3-D holografiska system. Molekylerna och strukturerna i levande celler märktes med fluorescerande proteiner, så att deras dynamiska beteende kan observeras genom denna nya 3D-fluorescensmikroskopi.

Bildtekniken som utvecklats av denna studie möjliggör 3D-bilder, som hittills har tagit jämförelsevis längre tid att generera via laserskanning, ska genereras i en enda bild utan att behöva skannas.

Nästa, som bilden till vänster i figur 1, är det holografiska 3-D fasavbildningssystemet. En levande växtcell består av komponenter som en kärna, mitokondrier, kloroplaster, och en tunn cellvägg. Det är möjligt att visualisera strukturerna för dessa komponenter från skillnaderna i fas (optisk väglängd). I detta system, Genom att använda Mach-Zehnder-interferometern kan referensplanvågen användas, vilket gör att den optimala interferenskanten för varje uppmätt objekt lätt kan erhållas.

Detta digitala holografiska mikroskop skapades genom att förena fluorescens- och fasmätningssystem.

Senare, detta mikroskop användes för att visualisera levande växtceller. Ett experiment utfördes för att bevisa att det är möjligt att utföra 4-D-observationer genom att tillämpa rumslig 3-D och en (endimensionell) tidsaxel. Moss Physcomitrella patens och fluorescerande pärlor med en medelstorlek på 10 μm användes. Figurerna 2 och 3 visar experimentresultaten för samtidig 3D-fluorescens och fasavbildning av mossan. Figur 2 (b) visar att sju kärnor är synliga när ett konventionellt fullfältsfluorescensmikroskop används. Av dessa sju kärnorna numrerade 1, 2, och 4 är i fokus, dock, detta är inte fallet för kärnorna på platser på olika djup eftersom det är en svag fluorescerande bild med utbredd suddighet. I den här studiens föreslagna metod för att lösa detta problem, fluorescerande ljusvågsinformation extraherades från det fluorescerande hologrammet i figur 2 (c). Baserat på denna information, den numeriska Fresnel-utbredningsalgoritmen kan erhålla rekonstruerade fluorescerande bilder på vilket djup eller avstånd som helst. Därför, i fokus bilder av flera fluorescerande kärnor på olika djup återställdes från en enda bild utan skanning.

Figur 2 (d), (e), och (f) visa de rekonstruerade bilderna på tre olika plan. Det axiella avståndet mellan (d) och (e) är 10 mikrometer, och 15 mikrometer mellan (e) och (f). De gula pilarna indikerar kärnorna som är i fokus. Det är möjligt att se vilka av de sju kärnorna i fluorescensbilden som är i fokus över de tre planen.

Figur 3 visar den kvantitativa fasfördelningen för de tre planen på olika djup. Det var möjligt att visualisera enskilda kloroplaster (det finns många runt kanterna på cellerna, som indikeras av de röda topparna i figur 3 (b)). Celltjockleken, beräknat från de uppmätta kvantitativa fasvärdena, var cirka 17 mikrometer, en storlek som ligger mycket nära andra referensvärden.

I figur 4, du kan se fluorescerande pärlor (omkring 10 mikrometer stora) som flyter i en lösning. Fas- och fluorescensinformationen genererades från inspelningar med den föreslagna metoden. Pärlorna rör sig också i djupled, så det är möjligt att hämta deras 3D-position genom att ändra rekonstruktionsavståndet för att hålla dem i fokus.

I den här studien, ett multimodalt digitalt holografiskt mikroskop utvecklades, kapabel till samtidiga 3D-fas- och fluorescensmätningar. Med förmågan att utföra kvantitativ fas- och fluorescensavbildning samtidigt, man tror att denna metod kommer att fungera som en ny grundteknik för visualisering av levande biologiska vävnader och celler. Särskilt, det har visat sig att detta mikroskop kan appliceras på komplexa växtceller. Det kan användas för att få en diversifierad förståelse av stamcellsbildningsprocessen i växter, som förökar sig lättare än djurceller. I framtiden, det kan vara möjligt att använda denna information för att kontrollera processen med stamceller via stimulering av ljus. Effektiv växtreproduktion och tillväxt som uppnås genom den föreslagna avbildningen och framtida stimulering skulle kunna tillämpas på utvecklingen av ett livsmedelsodlingssystem.

Denna teknik skulle kunna utvecklas genom att ytterligare förbättra ljusanvändningseffektiviteten. I digital holografi, det är nödvändigt att spatialt bredda strålens diameter, dela den i två, och sedan överlappa dem igen för att använda interferensen mellan de två ljusvägarna. Därför, det är också nödvändigt att öka den fluorescerande energin för att den ska kunna observeras av bildsensorn. För att uppnå detta, en stor mängd ljusenergi skulle krävas för att belysa de levande cellerna, dock, cellskador orsakade av ljuset skulle vara ett stort problem. Man tror att ett volymhologram skulle kunna användas för att öka ljusanvändningseffektiviteten samtidigt som man undviker cellulär fototoxicitet.

En annan fråga är att den rekonstruerade 3D-fördelningen sträcker sig in i ljusets utbredningsriktning (objektets djupriktning), minskande axiell upplösning. Forskarna arbetar med metoder som använder djupinlärning och filtrering för att undertrycka denna förlängning i djupled och förbättra bildkvaliteten.