Världen av laserskanningsmikroskopi utvecklas snabbt, tack vare tillkomsten av snabba och kompakta detektormatriser. Dessa arrayer ersätter den typiska enelementsdetektorn för traditionella konfokala laserskanningsmikroskop, vilket möjliggör nya och unika funktioner.
Medan konventionella detektorer endast tillhandahåller intensitetsvärdet för det insamlade ljuset, tillåter en pixlad detektor också att registrera den rumsliga fördelningen av infallande ljus, vilket effektivt skapar en liten bild av det upplysta området för varje skanningspunkt.
Den extra rumsliga informationen som tillhandahålls av detektormatriserna möjliggör en superupplösningsteknik som kallas bildskanningsmikroskopi (ISM). ISM bygger beräkningsmässigt en enda bild från en rå multidimensionell datauppsättning producerad av ett mikroskop. Den slutliga bilden är konstruerad med bättre signal-brusförhållande (SNR), optisk sektionering och rumslig upplösning än i ett traditionellt konfokalmikroskop.
I detalj kan den laterala upplösningen av ISM-bilden överträffa Abbes gräns upp till en faktor två. Dessa fördelar uppnås emellertid genom att endast utnyttja rumslig information; modern fluorescensbioavbildning kan berikas ytterligare genom tidsupplöst förvärv, vilket möjliggör tillgång till strukturell och funktionell information kodad i fluorescensdynamiken (t.ex. fluorescenslivslängd).
Nyligen utvecklade forskare vid det italienska tekniska institutet (IIT) i Genua ett kompakt och effektivt ISM-mikroskop utrustat med en enda foton lavindiod (SPAD) array-detektor som kan ge högupplöst strukturell och funktionell avbildning i en enda arkitektur. Forskningen publiceras i Advanced Photonics .
Den rapporterade SPAD-arraydetektorn innefattar 25 oberoende dioder arrangerade i ett kvadratiskt rutnät. Den lilla storleken och den asynkrona avläsningen möjliggör snabb detektering av infallande fluorescensfotoner. Datainsamlingsschemat, baserat på DFD-metoden (digital frequency domain), är en heterodyn samplingsteknik som möjliggör konstruktion av fluorescensavklingningshistogrammet med en tidsupplösning ner till 400 ps, lämplig för de flesta fluorescensavbildningstillämpningar.
Tekniken är tillräckligt enkel för att möjliggöra histogramberäkning på samma FPGA-kort (field-programmable-gate-array) som används för att styra mikroskopet och registrera den detekterade signalen, vilket förenklar mikroskoparkitekturen.
Tack vare den unika rumsliga och tidsmässiga informationen som tillhandahålls av SPAD-arraydetektorn, visade författarna kombinationen av mätningar av fluorescenslivstid (FL) med ISM (FLISM). Utöver de konventionella ISM-fördelarna, möjliggör den förbättrade SNR för FLISM-bilderna en mer robust fluorescenslivslängdsuppskattning.
Rapporten belyser mikroskopets mångsidighet genom att kombinera ISM och tidsupplösta mätningar med stimulerad emission depletion (STED) mikroskopi, med hjälp av separation by lifetime tuning (SPLIT) teknik. Resultatet är en bild med förbättrad lateral upplösning och kontrast som erhålls utan att modifiera inhämtningsschemat. Dessutom möjliggör tidsupplösta mätningar multiartsavbildning med en enda detektor för ökad strukturell specificitet.
Systemet kan särskilja olika färgämnen med deras fluorescenslivstidsvärden, tack vare fasrepresentationen av fluorescensdynamik. Även om man använder färgämnen med liknande livslängdsvärden och överlappande excitationsspektra, kan det särskilja de olika fluoroforerna med hjälp av den pulserade interfolieringstekniken.
Genom att alternerande excitationspulser av laser med olika färger, kodas faktiskt den spektrala informationen effektivt in i den tidsmässiga dimensionen. Tack vare den utmärkta tidsupplösningen hos det föreslagna mikroskopet kan bidraget från de två fluorescerande färgämnena senare separeras för att undvika överhörning.
Enligt Giuseppe Vicidomini, chefsutredare vid Molecular Microscopy and Spectroscopy Lab vid IIT och motsvarande författare, "Resultaten av detta arbete tyder på att framtiden för laserskanningsmikroskopi är tätt kopplad till SPAD-arraydetektorer, som kan berika mikroskopidatasetet med ytterligare rumslig och tidsmässig information utan att behöva ändra den optiska arkitekturen hos ett konfokalmikroskop."
Arbetet visar att SPAD-arraydetektorer i kombination med ett skräddarsytt insamlingssystem gör fotonupplöst ISM lättillgänglig och användbar.
Mer information: Giorgio Tortarolo et al, Kompakt och effektivt fotonupplöst bildskanningsmikroskop, Avancerad fotonik (2024). DOI:10.1117/1.AP.6.1.016003
Tillhandahålls av SPIE
