Grafik som visar den NIST-designade sackarosdensitetsgradienten som används för att separera överskott av konstruerade nanopartiklar (ENP) i lösning från rundmaskar och eventuella ENP som de konsumerade. Lösa eller externt fästa ENP är fångade i det översta saltskiktet och sackarosskikten med lägre densitet. Maskar med intagna ENP rör sig nedåt för att slå sig ner i sackarosskikten med högre densitet. Kredit:M. Johnson/NIST
Ibland ger gammaldags metoder de bästa sätten att studera banbrytande teknik och dess effekter på den moderna världen.
Att ge en 65 år gammal laboratorieteknik en ny roll, forskare vid National Institute of Standards and Technology (NIST) har utfört den renaste separationen hittills av syntetiska nanopartiklar från en levande organism. Den nya NIST-metoden förväntas avsevärt förbättra experiment som tittar på de potentiella miljö- och hälsoeffekterna av dessa tillverkade enheter. Det kommer att göra det möjligt för forskare att mer exakt räkna hur många nanopartiklar som faktiskt har intagits av organismer som exponerats för dem.
En artikel som beskriver den nya metoden finns i det aktuella numret av tidskriften ACS Nano .
Den vanliga spolmasken Caenorhabditis elegans har de senaste åren använts som en levande modell för laboratoriestudier av hur biologiska och kemiska föreningar kan påverka flercelliga organismer. Dessa föreningar inkluderar konstruerade nanopartiklar (ENP), materialbitar mellan 1 och 100 nanometer (miljarddelar av en meter, eller ungefär 1/10, 000 diametern av en röd blodkropp). Tidigare forskning har ofta fokuserat på att kvantifiera mängden och storleken på konstruerade nanopartiklar som intas av C. elegans. Att mäta nanopartiklarna som faktiskt gör det till en organism anses vara en mer relevant indikator på potentiell toxicitet än bara mängden ENP som maskarna utsätts för.
Traditionella metoder för att räkna intagna ENP har gett tveksamma resultat. För närvarande, forskare exponerar C. elegans för metall ENP som silver eller guld i lösning, skölj sedan bort överflödiga partiklar med vatten följt av centrifugering och frystorkning. En del av det "rengjorda" provet som produceras undersöks sedan vanligtvis med en teknik som bestämmer mängden metall som finns närvarande, känd som induktivt kopplad plasmamasspektrometri (ICP-MS). Det ger ofta ENP-tal i tiotusentals per mask; dock, dessa siffror verkar alltid vara för höga för NIST-forskare som arbetar med C. elegans.
"Eftersom ICP-MS kommer att upptäcka alla nanopartiklar som är associerade med maskarna, både de som intas och de som förblir fästa externt, vi misstänker att det senare är det som gör att antalet "ENP" per mask är så högt, " sa NIST analytiska kemist Monique Johnson, huvudförfattaren på ACS Nano-papperet. "Eftersom vi bara ville kvantifiera de intagna ENP, en mer robust och pålitlig separationsmetod behövdes."
Lyckligtvis, lösningen på problemet fanns redan i labbet.
En svepelektronmikrofotografi som visar ett tvärsnitt av spolmasken C. elegans med två intagna konstruerade nanopartiklar (röda prickar precis till höger om mitten). Bilder som denna gav NIST-forskare en visuell bekräftelse på att konsumtion av nanopartiklar faktiskt inträffade. Kredit:K. Scott/NIST
Under odlingen av C. elegans för ENP-exponeringsexperiment, Johnson och hennes kollegor hade använt sackarosdensitetsgradientcentrifugering, ett decennier gammalt och etablerat system för att rengöra cellulära komponenter, för att isolera maskarna från skräp och bakterier. "Vi undrade om samma process skulle tillåta oss att utföra en organism-från-ENP-separation också, så jag utformade en studie för att ta reda på, " sa Johnson.
I deras experiment, NIST-forskarna exponerade först separata prover av C. elegans för låga och höga koncentrationer av två storlekar av guld nanosfärer, 30 och 60 nanometer i diameter. Forskarna lade vart och ett av proverna i en centrifug och tog bort supernatanten (vätskedel), lämnar maskarna och ENP i de återstående pellets. Dessa centrifugerades två gånger i en saltlösning (snarare än bara vatten som i tidigare separationsmetoder), och sedan centrifugerade igen, men den här gången, genom en unikt utformad sackarosdensitetsgradient.
"Från topp till tå, vår gradient bestod av ett saltlösningsskikt för att fånga överskott av ENP och tre allt tätare skikt av sackaros [20, 40 och 50 procent] för att isolera C. elegans, " förklarade Johnson. "Vi följde upp gradienten med tre vattensköljningar och med centrifugeringar för att säkerställa att endast maskar med intagna ENP, och inte sackarosseparationsmediet med överskott av ENP, skulle göra det till den sista pelleten."
Att analysera mängden massor i de ultrarenade proverna visade att guldnivåer var mer i linje med vad forskarna förväntade sig skulle hittas som intagna ENP. Experimentell validering av NIST-separationsmetodens framgång kom när maskarna undersöktes i detalj under ett svepelektronmikroskop (SEM).
"För mig, eureka-ögonblicket var när jag först såg guld ENP i tvärsnittsbilderna tagna från C. elegans-proverna som hade bearbetats genom sackarosdensitetsgradienten, " sa Johnson. "Jag hade drömt om att hitta ENP i maskens matsmältningskanal och nu var de verkligen där!"
De högupplösta SEM-bilderna gav också visuella bevis för att endast intagna ENP räknades. "Inga ENP var fästa vid nagelbandet, exoskelettet av C. elegans, i något av sackarosdensitetsgradientproverna, ", sa Johnson. "När vi undersökte maskar från våra kontrollexperiment [bearbetade med den traditionella no-gradienten, separationsmetod för endast vattensköljning], det fanns ett antal nanosfärer fästa vid nagelbandet.
Nu när det framgångsrikt har demonstrerats, NIST-forskarna planerar att förfina och ytterligare validera sitt system för att utvärdera upptagandet av ENP av C. elegans. "Förhoppningsvis, vår metod kommer att bli ett användbart och värdefullt verktyg för att minska mätvariabiliteten och provtagningsbias som kan plåga miljöstudier av nanotoxikologi, " sa Johnson.
