Forskare vid Tokyo Institute of Technology, RIKEN, och Kyoto Institute of Technology har tillämpat rationell kristalldesign för att skapa proteinkristaller med utökat poröst nätverk för att ackumulera exogena molekyler inuti levande celler. Detta arbete lägger en grund för konstruktion av stabila självmonterande kristallina porösa material som kan koncentrera och bevara bioaktiva ämnen i olika celltyper.

I naturen, proteiner samlas i sofistikerade och högordnade strukturer, som gör det möjligt för dem att utföra många funktioner som stöder olika former av liv. Den utsökta designen av naturliga proteiner fick forskare att utnyttja den i syntetisk biologi för att konstruera molekyler som kan samlas i nanopartiklar med önskad struktur och som kan användas för olika ändamål, till exempel gaslagring, enzymkatalys, intracellulär läkemedelsleverans, etc.

Cytoplasmatiska polyhedrosvirus (cypovirus) som infekterar insekter är inbäddade i proteinkristaller som kallas polyeder som skyddar viruset från skador. Strukturen av polyederkristaller (PhC) antyder att de kan fungera som robusta behållare som kan införliva och skydda främmande molekyler från nedbrytning, säkerställa deras kompositionella och funktionella stabilitet.

Översikt över forskningsresultat

Extrem stabilitet av polyeder under hårda förhållanden tillhandahålls genom tät packning av polyhedrinmonomerer i kristaller med lösningsmedelskanaler med mycket låg porositet, som, dock, begränsar införlivandet av främmande partiklar. Forskargrupp under ledning av Satoshi Abe och Takafumi Ueno vid Tokyo Institute of Technology antog att om ett poröst ramverk inuti PhC utvidgas utan att äventyra kristallstabiliteten, PhC kan användas för ackumulering och lagring av exogena molekyler i levande celler. Som i naturliga PhC, polyhedrinmonomerer bildar en trimer, forskarna antog att om aminosyrarester vid kontaktgränssnittet för varje trimer raderas, porositeten hos de resulterande kristallerna skulle ökas. För att uppnå detta mål, de genetiskt konstruerade polyhedrinmonomerer, som sedan uttrycktes och självmonterades i Spodoptera frugiperda IPLB-Sf21AE, larven av en armmaskfjäril, infekterad med baculovirus. De mutanta PhC:erna upprätthöll kristallgitter av vildtyp PhC men hade signifikant förlängd porositet (figur) på grund av radering av aminosyrarester med omarrangemang av intra- och intermolekylära vätebindningar. Som ett resultat, de konstruerade kristallerna kunde adsorbera 2-4 gånger fler exogena molekyler (fluorescerande färgämnen) jämfört med vildtyp PhC, med upp till 5, 000-faldig kondensering av färgämnena från 10 uM-lösningen.

Som ett nästa steg, forskarna undersökte prestanda hos de mutanta kristallerna i levande insektsceller. PhC visade hög stabilitet i den intracellulära miljön. Viktigast, de mutanta kristallerna kan ackumuleras och behålla färgämnena i levande celler, medan de naturliga kristallerna inte kunde.

Rationell kristalldesign som används av forskare vid Tokyo Institute of Technology ger ett kraftfullt verktyg för strukturell manipulation av självmonterade proteinkristaller för att erhålla porösa nanomaterial med reglerade adsorptionsegenskaper. De konstruerade porösa PhC:erna kan användas som proteinbehållare för in vivo kristallstrukturanalys av cellulära molekyler och bioortogonal kemi i olika typer av levande celler.

Strukturell analys av mikrokristaller

Eftersom små kristaller med endast några mikronstorlek erhölls, strukturanalyserna utfördes vid beamlines BL32XU och BL41XU vid SPring-8, en stor synkrotronstrålningsanläggning som levererar den mest kraftfulla synkrotronstrålningen. Högupplösta strukturer analyserades snabbt med hjälp av ett automatiserat datainsamlingssystem utvecklat i RIKEN.