Forskare studerar ofta biomolekyler som proteiner eller aminosyror genom att kemiskt fästa en "fluorofor", en känslig molekyl som absorberar och återutsänder energi från ljus.
När de aktiveras av en laser och avbildas genom ett kraftfullt mikroskop, exploderar dessa fluoroforetiketter eller etiketter i en regnbåge av färg och information. De ger en mängd insikter som till exempel kan hjälpa till att upptäcka sjukdomar eller identifiera genetiska tillstånd.
För att detektera mer än en typ av molekyl åt gången, eller "multiplex" mätningar, används ytterligare typer av fluoroforer som avger olika färger av ljus. Men det är förvånansvärt svårt att skilja olika färger åt på singelmolekylnivå. Det är därför de flesta mikroskop bara tittar på tre till fyra färger.
Forskare kan bryta denna färgbarriär med hjälp av avancerade tekniker som involverar dagar långa rundor av märkning och bildbehandling eller använda komplicerade inställningar med många lasrar. Att hitta ett enkelt och snabbt sätt att se många färger har dock förblivit en stor utmaning.
Forskare vid UChicago Pritzker School of Molecular Engineering har en ny lösning på denna utmaning, som beskrivs i en artikel som publicerades idag i Nature Nanotechnology . En ny teknik som beskrivs av Squires Lab använder tre enkla kemiska byggstenar för att konstruera dussintals "FRETfluor"-taggar, vilket skapar ett vackrare, nyanserat spektrum av färger som forskare kan använda för att märka biomolekyler.
"Vårt tillvägagångssätt är enklare. Det är ett skott av märkning, ett skott av bildbehandling," sade medförfattaren Jiachong Chu, en UChicago Pritzker Molecular Engineering Ph.D. kandidat. "Det betyder att du kan göra mer med mindre. För närvarande är vår nya teknik den bästa på området."
Enskilda molekyler är små och cellprover är jämförelsevis stora, komplicerade och röriga. Det slutliga målet för detta forskningsområde – ett som PME-teamets uppsats lägger närmare än någonsin – är multiplexering.
"Multiplexing av prover innebär att i samma mätning kunna mäta mer än en art av molekyler så kanske du har 10 eller 50, eller hundratals olika proteiner som du vill identifiera", säger Neubauer Family Assistant Professor of Molecular Engineering Allison Squires. "Med den här nya tekniken kan vi göra dussintals. Jag tror att vi kan utöka det till hundratals."
För att tackla denna utmaning hittade Squires Lab-teamet ett innovativt nytt sätt att använda en väletablerad teknik:Förster Resonance Energy Transfer eller FRET. FRET är en mekanism som beskriver hur energi överförs mellan ljuskänsliga molekyler. Det är ett sätt för forskare att mäta avståndet mellan olika delar av en molekyl, eller att rapportera när två molekyler interagerar. FRET-signaler är exceptionellt känsliga för egenskaperna hos de deltagande fluoroforerna, som UChicago-teamet använde för att ställa in sina FRETfluor-etiketter.
"Det här projektet använder FRET på ett nytt sätt", säger medförfattaren Ayesha Ejaz, en Ph.D. kandidat i kemi. "FRET används ofta för att mäta avstånd och observera dynamik i biomolekyler. Vi ändrade avståndet mellan ett donator- och acceptorfärgämne för att skapa olika FRET-effektiviteter och andra egenskaper som vi använder för att identifiera de olika konstruktionerna."
De 27 taggarna som användes i PME-teamets forskning var 27 "FRETfluors" som de designade med en enkel kombination av DNA, ett grönt cyaninfärgämne (Cy3) och ett rött cyaninfärgämne (Cy5). Förutom att glöda i olika färger, uppvisar FRETfluors var och en andra avstämbara egenskaper såsom tidpunkten för hur fotoner emitteras, eller vilka orienteringar dessa fotoner har.
Tillsammans kan dessa egenskaper användas för att identifiera en FRETfluor på bara en bråkdel av en sekund, vid ultralåga koncentrationer. Ejaz sa att en möjlig framtida riktning för denna forskning är att så småningom ersätta vanliga fluorofor-taggar med dessa FRETfluors.
"Vanligtvis, när människor vill titta på flera saker - som olika delar av en cell - samtidigt, märker de varje komponent med en annan fluorescerande etikett som avger en viss färg av ljus. Men fluorescerande etiketter är begränsade till fyra eller fem färger ," sa Ejaz.
"Om FRETfluor kan användas istället, då kan vi öka antalet "färger" som är tillgängliga för fluorescensmikroskopi. Vi testar för närvarande hur väl FRETfluorerna fungerar i olika typer av experiment och miljöer vilket kommer att ge oss en bättre förståelse för alla möjligheterna."
"Jag är exalterad över att se FRETfluors i aktion," sa hon.
För Squires kommer mycket av tilltalandet av den nya multiplexeringstekniken från känslighet kombinerat med enkelhet.
"Alla vill multiplexa sin favoritanalys, och det finns massor av befintliga strategier som fungerar i vissa situationer," sa hon. "Det finns tekniker som fungerar bra när du har massor av tid, eller när ditt prov är dött så att ingenting rör sig.
"Vi angriper problemet där du inte har massor av tid. Du vill veta vilken sjukdom någon har medan det fortfarande finns tid att bekämpa den, eller så har du bara en liten liten bit av provet och du får en chans att identifiera varje molekyl när den strömmar genom din kanal. Vi kan identifiera FRETfluorer på en bråkdel av en sekund ner till tiotals femtomolära koncentrationer."
Enkelhet är nyckeln, både genom att använda vanliga kemikalier för att göra FRETfluors och genom att banbryta en teknik som bara behöver en laser för avläsning.
"Vi märker bara till mål en gång och gör bara avläsningen en gång," sa Chu. "Under det sammanhanget kan vi skapa 27 olika taggar som kan användas samtidigt."
Squires beskrev hur befintliga tekniker kunde användas tillsammans med FRETfluors för fler multiplexeringsvinster – "du kan introducera snygga laserexciteringsscheman eller inkorporera andra fluoroforer som har något annorlunda egenskaper" – som skulle förbättra avläsningarna från befintliga etiketter.
Att tillämpa dessa multiplikatorer på sin nya, kraftfullare teknik, sa Squires, kan öppna upp världar av ny forskning och tillämpningar.
"Dessa förbättringar av bildbehandling och flödesbaserade biomedicinska analyser kommer att möjliggöra nästa generations innovation," sa Squires.
Mer information: Jiachong Chu et al, Single-molecule fluorescence multiplexing genom multi-parameter spektroskopisk detektion av nanostrukturerade FRET-etiketter, Nature Nanotechnology (2024). DOI:10.1038/s41565-024-01672-8
Journalinformation: Nanoteknik
Tillhandahålls av University of Chicago
