Mikrofluidiska system används inom molekylärbiologi, biokemi och bioteknik för att snabbt analysera heterogena biomolekylära blandningar med höga återvinningshastigheter och små provvolymer. Dock, det är utmanande att kombinera förberedande och analytiska processer i en enda enhet för snabb integrerad analys. I en nyligen publicerad studie nu publicerad på Mikrosystem och nanoteknik , Kadi L. Saar och medarbetare vid de tvärvetenskapliga avdelningarna för kemi, fysik, och Fluidic Analytics Limited i Cambridge, STORBRITANNIEN., har utvecklat ett chip som kombinerar de två stegen förberedelse och analys.

Initialt, de använde spänning för att separera proteinmolekyler i en binär blandning av lika stora biomolekyler som inte kunde urskiljas via konventionella dimensionerings- eller upplösningstekniker. Därefter, forskargruppen använde den nya enheten för att få ett 2D-fingeravtryck av en heterogen proteinblandning. Resultaten kommer att öppna nya möjligheter att få snabb multiparameterdata om biomolekylära system på kort tidsskala.

Mikrofluidiktekniker är attraktiva att analysera biologiska prover på grund av mycket låga provbehov och en hög återvinningsgrad. Plattformarna kan ge oöverträffad analyshastighet på nivån för enskilda driftenheter eller förse flera enheter med direkt kombinerat arbetsflöde, utan provöverföring mellan enheterna. Sådana överföringar sker genom kopplingar eller rör och inför dispersion till provet, påverkar systemets prestanda. Arbetsflödet som föreslås häri kan separera heterogena blandningar för att bestämma komponenterna av intresse och minska komplexiteten för vidare bearbetning av blandningen för dess rening.

Forskare hade tidigare introducerat en mängd kontinuerliga flödesbaserade molekylära separationsstrategier i mikronskala, inklusive friflödeselektrofores, dielektrofores, magnetofores och akustoforetisk separation. Detektionsstrategier som laser- eller LED-inducerad fluorescens (LIF), kemiluminescens eller elektrokemiska tillvägagångssätt kan vara ingrodda parallellt inom sådana mikrofluidiska separationsplattformar. Analytisk information om de separerade föreningarna kan uppnås med offlinestrategier som masspektroskopi eller SDS-PAGE, men teknikerna kan begränsa bearbetningshastigheten i en enda enhet, orsakar provförlust eller kontaminering.

Saar et al. utvecklade därför helt integrerad separation och kvantitativ karakterisering av heterogena biomolekylära prover i en enda mikrofluidisk enhet för att övervinna de befintliga gränserna genom att direkt koppla on-chip-separation till on-chip-analys och molekylstorlek. Designfunktionen möjliggjorde analys av en specifik fraktion genom att justera den applicerade fältstyrkan. De designade enheten för att identifiera separerade fraktioner som liknar SEC-MALS (storleksuteslutningskromatografi med flervinkelljusspridning) eller LC (chip)-MS ((på-chip)-vätskekromatografi-masspektrometri) metoder.

Enheten hade den ytterligare fördelen att utföra hela processen helt invandad för elektroforetisk separation i fri lösning, gör det möjligt för forskare att få fram en kvantitativ karta på några minuter – mycket snabbare än konventionella tekniker. Blandningen var opåverkad av det bärande mediet, och forskarna kunde studera både svaga och icke-kovalenta molekylära interaktioner.

Saar et al. konstruerade enheten med användning av en kvantitativ elektroforesenhet med naturlig fas kopplad till en MDS-enhet (microfluidic diffusional device sizing). Den kombinerade plattformen tillät komponenter med specifik elektroforetisk rörlighet (µ _e1 ) för on-chip nedströmsanalys, som en funktion av den applicerade elektriska fältstyrkan. De designade tre kanaler nedströms elektroforesenheten för att hålla elektrolysprodukter borta från chipet utan att komma in i enheten. De minimerade antalet individuella enheter som drev flödet i enheten, kopplad till stabil enhetsdrift för kvantitativ provkarakterisering. Forskarna höll elektrolytens utlopp åtskilda från den kombinerade enheten för att applicera elektrisk potential över enheten utan att generera en elektrisk kortslutning, och att möjliggöra ett effektivt avlägsnande av alla elektrolysprodukter utan ackumulering för att förhindra tryckfluktuationer.

Forskargruppen tillämpade den elektriska potentialen på metalliska kontakter för att generera ett metall- och vätskegränssnitt utanför chipet i enlighet med enhetsprototypen designad av samma team. I det här arbetet, Saar et al. designade en Y-formad flödesdelare och höll isär strömmarna tills de nådde splittern för att förhindra partiell kortslutning. De beräknade flödet av elektrolyten in i enheten för att ha en effekt på enhetens prestanda.

Totalt, mikrofluidikplattformen med separationsenheten riktade en del av vätskeflödet till en MDS-enhet, som forskargruppen kopplade till analytiska SEC-MALS för att identifiera fraktionerna som lämnar separationsmodulen. För att analysera data och erhålla genomsnittlig molekylstorlek för varje fraktion, de använde en numerisk lösare som förutsäger genereringen av partikelfördelningar. Saar et al. jämförde de förutsagda fördelningarna med experimentella data och extraherade de hydrodynamiska radierna för partiklarna i varje fraktion.

De avbildade munstycket där provet mötte bärarmediet som en referenspunkt för partikelrörelse. Forskarna justerade diffusionsdimensioneringskanalen eller flödeshastigheten för att exakt dimensionera analytmolekylerna, storleksordningar större eller mindre i storlek. Eftersom de konstruerade mikrofluidikplattformen med poly(dimetylsiloxan) (PDMS), forskarna eliminerade all autofluorescens i installationen innan de analyserade bilddata.

De använde sedan enheten för att analysera en binär blandning av provproteiner; bovint serumalbumin och humant lysozym. För att bevara de naturliga tillstånden hos proteinmolekylerna avbildade de de etikettfria proverna med ett hemmabyggt UV-våglängdsbaserat mikroskop och kvantifierade provets inneboende fluorescens. Saar et al. bekräftade förmågan att separera blandningen i dess komponenter genom att först applicera en uppsättning spänningar för att registrera de fluorescerande profilerna. De registrerade sedan proteinernas elektroforetiska rörlighet (µ _e1 ) kombinerat med flödeshastigheten i enheten för att karakterisera de flesta proteiner och deras komplex. Forskarna ändrade flödeshastigheten eller den applicerade spänningen för att analysera biomolekyler med olika biofysiska parametrar.

Med hjälp av plattformen, de karakteriserade snabbt blandningar av molekyler i nanoskala, där individuella analyter visade liknande storlekar men olika elektroforetiska egenskaper. Baserat på det resulterande histogrammet, forskargruppen bekräftade närvaron av två distinkta prover. Jämförelsevis, i en off-chip konventionell separationsmetod, det senare steget krävde fraktionering genom provöverföring från ett analysverktyg till ett annat via sammankopplade rör, begränsa enhetens prestanda. Den totala proteinkoncentrationen i studien var ungefär 100 µM och forskarna upptäckte exakt känslighetsgränsen till ungefär 100 nM, i förhållande till den inneboende fluorescensen av proteinfraktioner. För optiskt icke-aktiva föreningar, Saar et al. föreslå en alternativ detektions- och karakteriseringsstrategi, såsom torrmassaavkänning.

Saar et al. använde strategin för att erhålla tvådimensionella (2-D) karakteristiska kartor över proteinblandningen som ett proof-of-concept. De extraherade kvantitativ information från separationssteget och relaterade de applicerade potentialerna till artens elektroforetiska rörlighet för att uppskatta enhetens effektivitet. De registrerade strömmen som flyter i systemet under normal drift och när separationskammaren kortslutits för att uppskatta enhetens och elektrodernas totala elektriska resistans.

Forskarna beräknade den elektroforetiska rörligheten som rörelsen av en partikel i ett elektriskt fält för var och en av fraktionerna. Baserat på experimentella data, den konstruerade 2-D karakteristiska kartan inkluderade den effektiva laddningen (q) och den hydrodynamiska radien (Rh) för blandningen. De resulterande elementära laddningsenheterna för de specifika proteinerna överensstämde med uppskattade värden någon annanstans. De erhöll den fullständiga tvådimensionella kartan genom att endast övervaka en enda bildram för snabb lösningsanalys.

Den analytiska tiden för mikrofluidikanordningen från separation till diffusionsdimensionering och avbildning var ungefär 14 sekunder. Forskarna konstruerade den experimentella 2D-kartan med endast 3 µL prov under sju minuter totalt, storleksordningar snabbare än tidsskalan för att utföra konventionella 2D-proteingeler. Forskargruppen genomförde ett brett utbud av biomolekylära interaktioner, i lösning, direkt under inhemska förhållanden som tidigare var utmanande att utföra i labbet.

På det här sättet, Kadi L. Saar och hans medarbetare utvecklade en mikrofluidisk enhet som kombinerar separation på chip med direkt analys på chip för att ersätta de befintliga konventionella metoderna i mikroskala. Använda enheten, de analyserade snabbt en binär blandning av proteiner som inte kunde identifieras som individuella komponenter via befintliga lösningsdimensioneringsmetoder. De konstruerade en 2-D karakteristisk karta över den heterogena blandningen på en snabb tidsskala för att öppna möjligheten för proteinkarakterisering i lösning med en aldrig tidigare skådad tidsupplösning jämfört med befintliga biofysiska tekniker.

© 2019 Science X Network