Figur 1:(a) Förklarande skiss av plasmamembranet förankrat nanosensor. De föreningar som används för konjugering av guldnanopartiklar (AuNP) är den H2O2-känsliga 4-merkaptofenylboron-pinakolestern (4MPBE) och Biotin-HPDP. Biotinylering av plasmamembranproteinektodomen uppnås med NHS-Biotin. Förankringen av det konjugerade AuNP och NHS-Biotin ges genom att Streptavidin reagerar med de två biotindelarna. (b) AFM -analys utfördes på A549 lungcancerceller efter nanosensorförankring och fixering. Högupplösta AFM-bilder bekräftade närvaron av nanosensorn, som är i kontakt med cellytan och kan detektera endogent H2O2 i ett mycket grunt område (dvs. 90 nm) av den extracellulära vätskan i kontakt med plasmamembranet. Upphovsman:Kanazawa University
Forskare vid Kanazawa University rapporterar i Biosensorer och bioelektronik ett framgångsrikt test av en sensor för mätning av väteperoxidkoncentrationer nära cellmembran. Sensorn har potential att bli ett verktyg för nya cancerterapier.
Flera processer i människokroppen regleras av biokemiska reaktioner som involverar väteperoxid (H 2 O 2 ). Även om det kan fungera som en 'sekundär budbärare, " vidarebefordra eller förstärka vissa signaler mellan celler, H 2 O 2 är i allmänhet giftig på grund av dess oxiderande karaktär. Det senare innebär att det omvandlar (oxiderar) biokemiska molekyler som proteiner och DNA. Oxiderande egenskap hos H 2 O 2 är av potentiell terapeutisk relevans för cancer, dock:medvetet orsakar tumörceller att öka deras H 2 O 2 koncentration skulle vara ett sätt att förstöra dem. I ljuset av detta, men också för att övervaka patologier associerade med H 2 O 2 överproduktion, det är avgörande att ha ett sätt att på ett tillförlitligt sätt kvantifiera väteperoxidkoncentrationer i den extracellulära miljön. Nu, Leonardo Puppulin från Nano Life Science Institute (WPI-NanoLSI), Kanazawa University och kollegor har utvecklat en sensor för att mäta koncentrationer av H 2 O 2 i närheten av cellmembran, med nanometerupplösning.
Biosensorn består av en guldnanopartikel med organiska molekyler fästa vid den. Hela klustret är utformat så att det lätt förankras på utsidan av en cells membran, vilket är exakt där väteperoxidmolekylerna som ska detekteras finns. Som bindningsmolekyler, forskarna använde en förening som heter 4MPBE, känt för att ha ett starkt Raman-spridningssvar:när det bestrålas av en laser, molekylerna förbrukar en del av laserljusets energi. Genom att mäta laserljusets frekvensförändring, och plotta signalstyrkan som en funktion av denna förändring, ett unikt spektrum erhålls - en signatur av 4MPBE -molekylerna. När en 4MPBE -molekyl reagerar med ett H 2 O 2 molekyl, dess Raman-spektrum förändras. Baserat på denna princip, genom att jämföra Raman -spektra, Puppulin och kollegor kunde få en uppskattning av H 2 O 2 koncentration nära biosensorn.
Figur 2:(a) Ytförstärkt Raman-spektroskopi användes för att detektera och kvantifiera den H2O2-inducerade modifieringen av 4MPBE-molekyler monterade på guldytan av nanosensorn förankrad till cellerna. Intensiteten hos Raman-bandet vid 998 cm-1 beror på H2O2-koncentrationen, medan bandet vid 1074 cm-1 inte visade modifiering och det kan användas för normalisering av spektrallinjerna. (b) Resultat av nanosensorkalibreringen. Förhållandet mellan intensiteten vid 1074 cm-1 och intensiteten vid 998 cm-1 visade linjärt beroende med avseende på H2O2-koncentration.(c) Exempel på SERS hyperspektral karta över extracellulär endogen H2O2 uppsamlad från ytan av A549-cellen som visas i ljusfältsbild. SERS-spektra som visas i (a) samlades in från platserna A och B. Kredit:Kanazawa University
Efter att ha utvecklat ett kalibreringsförfarande för deras nanosensor - relaterat till H 2 O 2 koncentration till en förändring i Raman -spektrum på ett kvantitativt sätt är inte okomplicerat - forskarna kunde ta fram en koncentrationskarta med en upplösning på cirka 700 nm för lungcancercellprover. Till sist, de lyckades också utöka sin teknik för att erhålla mätningar av H 2 O 2 koncentrationsvariation över cellmembranen.
Puppulin och kollegor drar slutsatsen att deras "nya tillvägagångssätt kan vara användbar för studiet av faktiska H 2 O 2 koncentrationer involverade i cellförökning eller död, som är grundläggande för att helt belysa fysiologiska processer och för att utforma nya terapeutiska strategier. "
Figur 3:(a) Förklarande schema över den extracellulära produktionen av H2O2 av NOX -komplex, den resulterande absorptionen genom Aquaporin -kanalen och reaktionen med intracellulärt peroxiredoxin. Vid stabilt tillstånd, koncentrationsförhållandet mellan extracellulär H2O2 och intracellulär H2O2 kan uppskattas genom förhållandet mellan hastighetskonstanten för H2O2-reduktion med peroxiredoxin (kprx) och hastighetskonstanten för H2O2-absorption genom plasmamembranet (kabs). (b)-(c) Typiska resultat av redoxbiologiska experiment med passningslinjer från vilka vi mätte kabs och kprx, respektive. (d) Genomsnittlig yta av extracellulär [H2O2]e och det typiska maximum av [H2O2]e uppmätt på A549-celler med den nydesignade nanosensorn. (e) Genomsnittlig intracellulär [H2O2]i och det typiska maximum av [H2O2]i uppskattat på A549-celler enligt modellen som rapporterats i (a) och med hjälp av resultaten från (b)-(d). Upphovsman:Kanazawa University
Biosensorn som utvecklats av Leonardo Puppulin från Kanazawa University och kollegor är baserad på en metod som kallas ytförstärkt Ramanspektroskopi (SERS). Principen härrör från Raman-spektroskopi, där skillnader mellan de inkommande och utgående frekvenserna av laserljus som bestrålas på ett prov analyseras. Spektrum som erhålls genom att plotta signalstyrkan som en funktion av frekvensskillnaden är karakteristiskt för provet, som i princip kan vara en enda molekyl. Vanligtvis, dock, signalen som kommer från en molekyl är för svag för att upptäcka, men effekten kan förstärkas när molekylen absorberas på en grov metallyta. Puppulin och kollegor tillämpade tekniken för att (indirekt) detektera väteperoxid; deras Raman-mottagliga molekyl är en förening som kallas 4MPBE, som modifieras vid exponering för väteperoxid.
