Ett internationellt team av forskare har för första gången använt en röntgenfri elektronlaser för att reda ut strukturen hos en intakt viruspartikel på atomnivå. Metoden som används minskar dramatiskt mängden virusmaterial som krävs, samtidigt som undersökningarna kan genomföras flera gånger snabbare än tidigare. Detta öppnar helt nya forskningsmöjligheter, som forskargruppen ledd av DESY-forskaren Alke Meents rapporterar i tidskriften Naturmetoder .

Inom det område som kallas strukturbiologi, forskare undersöker den tredimensionella strukturen hos biologiska molekyler för att ta reda på hur de fungerar. Denna kunskap förbättrar vår förståelse av de grundläggande biologiska processer som äger rum inuti organismer, till exempel hur ämnen transporteras in och ut ur en cell, och kan även användas för att utveckla nya läkemedel.

"Att känna till den tredimensionella strukturen hos en molekyl som ett protein ger stor insikt i dess biologiska beteende, " förklarar medförfattaren David Stuart, Direktör för Life Sciences vid synkrotronanläggningen Diamond Light Source i Storbritannien och professor vid University of Oxford. "Ett exempel är hur att förstå strukturen hos ett protein som ett virus använder för att "haka" på en cell kan innebära att vi kan designa ett försvar för cellen för att göra viruset oförmöget att attackera den."

Röntgenkristallografi är det överlägset mest produktiva verktyget som används av strukturbiologer och har redan avslöjat strukturerna hos tusentals biologiska molekyler. Små kristaller av proteinet av intresse odlas, och sedan belyst med högenergiröntgenstrålar. Kristallerna diffrakterar röntgenstrålarna på karakteristiska sätt så att de resulterande diffraktionsmönstren kan användas för att härleda kristallens rumsliga struktur - och därmed av dess komponenter - på atomär skala. Dock, proteinkristaller är inte i närheten av så stabila och robusta som saltkristaller, till exempel. De är svåra att växa, ofta förblir liten, och skadas lätt av röntgenstrålningen.

"Röntgenlasrar har öppnat en ny väg till proteinkristallografi, eftersom deras extremt intensiva pulser kan användas för att analysera även extremt små kristaller som inte skulle producera en tillräckligt ljus diffraktionsbild med andra röntgenkällor, ", tillägger medförfattaren Armin Wagner från Diamond Light Source. var och en av dessa mikrokristaller kan bara producera en enda diffraktionsbild innan den förångas som ett resultat av röntgenpulsen. För att utföra strukturanalysen, fastän, hundratals eller till och med tusentals diffraktionsbilder behövs. I sådana experiment, forskare injicerar därför en fin vätskestråle av proteinkristaller genom en pulsad röntgenlaser, som släpper en snabb sekvens av extremt korta skurar. Varje gång en röntgenpuls råkar träffa en mikrokristall, en diffraktionsbild produceras och registreras.

Denna metod är mycket framgångsrik och har redan använts för att bestämma strukturen hos mer än 80 biomolekyler. Dock, det mesta av provmaterialet går till spillo. "Träfffrekvensen är vanligtvis mindre än två procent av pulserna, så de flesta av de värdefulla mikrokristallerna hamnar oanvända i uppsamlingsbehållaren, säger Meents, som är baserad på Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) i Hamburg, ett samarbete mellan DESY, universitetet i Hamburg och tyska Max Planck Society. Standardmetoden kräver därför vanligtvis flera timmars stråltid och betydande mängder provmaterial.

För att använda den begränsade stråltiden och det dyrbara provmaterialet mer effektivt, teamet utvecklade en ny metod. Forskarna använder ett mikromönstrat chip som innehåller tusentals små porer för att hålla proteinkristallerna. Röntgenlasern skannar sedan chipet linje för rad, och idealiskt tillåter detta att en diffraktionsbild registreras för varje puls hos lasern.

Forskargruppen testade sin metod på två olika virusprover med hjälp av LCLS röntgenlaser vid SLAC National Accelerator Laboratory i USA, som ger 120 pulser per sekund. De laddade sin provhållare med en liten mängd mikrokristaller av bovint enterovirus 2 (BEV2), ett virus som kan orsaka missfall, dödfödslar, och infertilitet hos nötkreatur, och som är mycket svår att kristallisera.

I detta experiment, forskarna uppnådde en träfffrekvens - där röntgenlasern framgångsrikt riktade in sig på kristallen - på upp till nio procent. Inom bara 14 minuter hade de samlat in tillräckligt med data för att fastställa virusets korrekta struktur – vilket redan var känt från experiment med andra röntgenljuskällor – ner till en skala av 0,23 nanometer (miljondelar av en millimeter).

"Som vi förstår det, detta är första gången atomstrukturen hos en intakt viruspartikel har bestämts med hjälp av en röntgenlaser, Meents påpekar. "Medan tidigare metoder vid andra röntgenljuskällor krävde kristaller med en total volym på 3,5 nanoliter, vi lyckades använda kristaller som var mer än tio gånger mindre, med en total volym på bara 0,23 nanoliter."

Detta experiment utfördes vid rumstemperatur. Medan kylning av proteinkristallerna skulle skydda dem till viss del från strålningsskador, detta är i allmänhet inte möjligt när man arbetar med extremt känsliga viruskristaller. Kristaller av isolerade virusproteiner kan, dock, vara fryst, och i ett andra test, forskarna studerade det virala proteinet polyhedrin som utgör en viral ocklusionskropp för upp till flera tusen viruspartiklar av vissa arter. Viruspartiklarna använder dessa behållare för att skydda sig mot miljöpåverkan och kan därför förbli intakta under mycket längre tider.

För det andra testet, vetenskapsmannen laddade deras chip med polyhedrinkristaller och undersökte dem med röntgenlasern samtidigt som chippet hölls vid temperaturer under minus 180 grader Celsius. Här, forskarna uppnådde en träfffrekvens på upp till 90 procent. På bara tio minuter hade de spelat in mer än tillräckligt med diffraktionsbilder för att bestämma proteinstrukturen inom 0,24 nanometer. "För strukturen av polyhedrin, vi behövde bara skanna ett enda chip som var laddat med fyra mikrogram proteinkristaller; det är storleksordningar mindre än den mängd som normalt skulle behövas, " förklarar Meents.

"Vår metod minskar inte bara datainsamlingstiden och mängden prov som behövs, det öppnar också upp möjligheten att analysera hela virus med röntgenlaser, " Sammanfattar Meents. Forskarna vill nu öka kapaciteten på sitt chip med en faktor tio, från 22, 500 till cirka 200, 000 mikroporer, och ytterligare öka skanningshastigheten till upp till tusen sampel per sekund. Detta skulle bättre utnyttja potentialen hos den nya röntgenfrielektronlasern European XFEL, som just ska tas i drift i Hamburg-regionen och som kommer att kunna producera upp till 27, 000 pulser per sekund. Vidare, nästa generation chips kommer bara att exponera de mikroporer som för närvarande analyseras, för att förhindra att de återstående kristallerna skadas av spridd strålning från röntgenlasern.

Forskare från University of Oxford, Östra Finlands universitet, schweiziska Paul Scherrer-institutet, Lawrence Berkeley National Laboratory i USA och SLAC var också involverade i forskningen. Diamantforskare har samarbetat med teamet på DESY, mycket av utvecklingen och testningen av det mikromönstrade chippet görs på Diamonds I02 och I24 strållinjer.