Ett nyutvecklat mikroskop ger forskare ett kraftigt förbättrat verktyg för att studera hur neurologiska störningar som epilepsi och Alzheimers sjukdom påverkar neuronkommunikation. Mikroskopet är optimerat för att utföra studier med optogenetiska tekniker, en relativt ny teknik som använder ljus för att kontrollera och bild neuroner genetiskt modifierade med ljuskänsliga proteiner.

"Vårt nya mikroskop kan användas för att undersöka effekterna av olika genetiska mutationer på neuronal funktion, " sa Adam Cohen från Harvard University, USA, och ledare för forskargruppen som utvecklade mikroskopet. "En dag kan den användas för att testa effekterna av kandidatläkemedel på neuroner som härrör från personer med nervsystemet störningar för att försöka identifiera läkemedel för att behandla sjukdomar som inte har adekvata behandlingar just nu."

Det nya mikroskopet, heter Firefly, kan avbilda ett område med en diameter på 6 millimeter, mer än hundra gånger större än synfältet för de flesta mikroskop som används för optogenetik. Istället för att studera den elektriska aktiviteten hos en neuron, det stora avbildningsområdet gör det möjligt att trigga de elektriska pulser som neuroner använder för att kommunicera och sedan titta på dessa pulser som rör sig från cell till cell genom en stor neural krets som innehåller hundratals celler. I hjärnan, varje neuron ansluter vanligtvis till tusen andra neuroner, så att titta på det större nätverket är viktigt för att förstå hur neurologiska sjukdomar påverkar neuronal kommunikation.

I tidskriften The Optical Society (OSA). Biomedicinsk optik Express , Cohen och hans kollegor rapporterar hur de monterade det nya mikroskopet för mindre än $ 100, 000 med komponenter som nästan alla är kommersiellt tillgängliga. Mikroskopet avbildar inte bara ett stort område, men samlar också ljus extremt effektivt. Detta ger den höga bildkvaliteten och den snabba hastighet som krävs för att titta på neuronala elektriska pulser som var och en endast varar en tusendels sekund.

Använder ljus för att se neuroner elda

Det nya mikroskopet är idealiskt för att studera mänskliga neuroner som odlas i laboratoriet. Under det senaste decenniet har forskare har utvecklat mänskliga cellmodeller för många nervsystemet. Dessa celler kan genetiskt modifieras för att innehålla ljuskänsliga proteiner som tillåter forskare att använda ljus för att få neuroner att elda eller för att styra variabler som neurotransmittornivåer eller proteinaggregation. Andra ljuskänsliga fluorescerande proteiner förvandlar de osynliga elektriska pulserna som kommer från neuroner till korta blixtar av fluorescens som kan avbildas och mätas.

Dessa tekniker har gjort det möjligt för forskare att studera in- och utdata från individuella neuroner, men kommersiellt tillgängliga mikroskop är inte optimerade för att till fullo utnyttja potentialen hos optogenetiska metoder. För att fylla detta teknikgap, forskarna designade Firefly-mikroskopet för att stimulera neuroner med ett komplext mönster som innehåller en miljon ljuspunkter och sedan registrera de korta blixtar av ljusfluorescens som motsvarar elektriska pulser som avfyras av neuronerna.

Varje pixel av ljusmönstret kan oberoende stimulera ett ljuskänsligt protein. Eftersom pixlarna kan ha många olika färger, olika typer av ljuskänsliga proteiner kan utlösas samtidigt. Ljusmönstret kan programmeras för att täcka en hel neuron, stimulera vissa områden i en neuron eller användas för att belysa flera celler samtidigt.

"Detta optiska system ger en miljon ingångar och en miljon utgångar, så att vi kan se allt som händer i dessa neurala kulturer, "förklarade Cohen.

Efter att ha stimulerat neuronerna, mikroskopet använder en kameraavbildning med tusen bilder per sekund för att fånga fluorescensen som induceras av de extremt korta elektriska pulserna. "Det optiska systemet måste vara mycket effektivt för att detektera bra signaler inom en millisekund, "sa Cohen." En hel del teknik gick åt till att utveckla optik som inte bara kan avbilda ett stort område utan gör det med mycket hög ljusinsamlingseffektivitet. "

För att effektivt samla ljus över ett stort område, Firefly-mikroskopet använder en objektivlins om storleken på en läskburk snarare än den objektivlins som används av de flesta mikroskop. Forskarna använde också en optisk inställning som ökar mängden ljus som stimulerar neuronerna för att säkerställa att neuronerna avger ljus fluorescens vid avfyrning.

"Det enda anpassade elementet i mikroskopet är ett litet prisma placerat mellan neuronerna och objektivlinsen, " förklarade Cohen. "Denna viktiga komponent får ljuset att färdas längs samma plan som cellerna snarare än att komma in i provet vinkelrätt. Detta hindrar ljuset från att lysa upp material ovanför och under cellerna, minskande bakgrundsfluorescens som skulle göra det svårt att se att fluorescens faktiskt kommer från neuronerna. "

Tittar på 85 neuroner samtidigt

Forskarna demonstrerade sitt nya mikroskop genom att använda det för att optiskt stimulera och registrera fluorescensen från odlade mänskliga neuroner. "Neuronerna var en stor trasslig röra av spagetti, "sa Cohen." Vi visade att det var möjligt att lösa 85 enskilda neuroner samtidigt i en mätning som tog cirka 30 sekunder. "

Efter den första stimuleringen och avbildningen, forskarna kunde hitta 79 av de 85 cellerna en andra gång. Denna förmåga är viktig för studier som kräver att varje cell avbildas före och efter exponering för ett läkemedel, till exempel.

I en andra demonstration, forskarna använde mikroskopet för att kartlägga de elektriska vågorna som utbreder sig genom odlade hjärtceller. Detta visade att mikroskopet kunde användas för att studera onormala hjärtrytmer, som uppstår när de elektriska signalerna som koordinerar hjärtslag inte fungerar korrekt.

"Systemet vi utvecklat är utformat för att titta på ett relativt plant prov, t.ex. odlade celler, "sa Cohen." Vi utvecklar nu ett system för att utföra optogenetiska metoder i intakt vävnad, vilket skulle tillåta oss att titta på hur dessa neuroner beter sig i sitt infödda sammanhang. "

Forskarna har också startat ett bioteknikföretag som heter Q-State Biosciences som använder en förbättrad version av mikroskopet för att arbeta med läkemedelsföretag om läkemedelsupptäckt.