Det polsk-israeliska teamet från fakulteten för fysik vid universitetet i Warszawa och Weizmann Institute of Science har gjort ytterligare en betydande prestation inom fluorescerande mikroskopi. På sidorna av Optica journal presenterade teamet en ny metod för mikroskopi som, i teorin, har ingen upplösningsgräns. I praktiken, teamet lyckades visa en fyrfaldig förbättring över diffraktionsgränsen.

Den fortsatta utvecklingen av biologiska vetenskaper och medicin kräver förmåga att undersöka allt mindre föremål. Forskare måste undersöka strukturen av, och de ömsesidiga relationerna mellan, till exempel, proteiner i celler. På samma gång, de prover som observeras bör inte skilja sig från de strukturer som förekommer naturligt i biologiska organismer, vilket utesluter användningen av aggressiva procedurer och reagens. Även om det revolutionerade naturvetenskapen, det klassiska optiska mikroskopet är klart otillräckligt idag. På grund av ljusets vågliknande natur, ett optiskt mikroskop tillåter inte bildstrukturer som är mindre än cirka 250 nanometer. Som ett resultat, objekt närmare varandra än halva ljusets våglängd (vilket är cirka 250 nm för grönt ljus) kan inte urskiljas. Detta fenomen, känd som diffraktionsgränsen, ett av de största hindren för att observera de minsta biologiska strukturerna, forskare har länge försökt att övervinna. Elektronmikroskop ger storleksordningar bättre upplösning men tillåter bara undersökning av livlösa föremål, som måste placeras i vakuum och bombarderas av en elektronstråle. Av denna anledning, elektronmikroskopi kan inte användas för att studera levande organismer och de naturliga processer som förekommer i dem. Det är här fluorescensmikroskopi kommer in, därav den snabba utvecklingen av superupplösande fluorescensmikroskopi som ett område inom fysikaliska vetenskaper och de två Nobelpriser som redan delats ut för relaterad forskning – 2008 och 2014.

Nuförtiden finns flera tekniker för fluorescensmikroskopi tillgängliga, och några av dem har blivit utbredda inom biologisk avbildning. Vissa metoder, som PALM, STORM eller STED mikroskopi, kännetecknas av en ultrahög upplösning och tillåter kräsna objekt som ligger bara ett dussin nanometer från varandra. Dock, dessa tekniker kräver långa exponeringstider och en komplex procedur för biologisk provberedning. Andra tekniker, som SIM- eller ISM-mikroskopi, är lätta att använda, men erbjuder en mycket begränsad upplösningsförbättring, tillåter att identifiera strukturer som endast är hälften av storleken på diffraktionsgränsen.

Aleksandra Sroda, Adrian Makowski och Dr. Radek Lapkiewicz från Quantum Optics Lab vid fakulteten för fysik vid universitetet i Warszawa, i samarbete med Dr. Ron Tenne, Uri Rossman, Gur Lubin och prof. Dan Oron från Weizmann Institute of Science i Israel, har introducerat en ny teknik för superupplösningsmikroskopi, kallas Super-resolution optisk fluktuationsbild scanning microscopy (SOFISM). I SOFISM, de naturligt förekommande fluktuationerna i emissionsintensiteten för fluorescerande markörer används för att ytterligare förbättra den rumsliga upplösningen hos ett bildskanningsmikroskop (ISM). ISM, en framväxande superupplösningsmetod, har redan implementerats i kommersiella produkter och visat sig vara värdefullt för bioavbildningssamhället. I stora drag, eftersom det uppnår en blygsam förbättring i sidoupplösning (x2), med väldigt få ändringar av den optiska inställningen och utan det gemensamma handikappet med långa exponeringstider. Således, det möjliggör en naturlig förlängning av kapaciteten hos ett standard konfokalmikroskop. ISM använder ett konfokalmikroskop där en enda detektor ersätts med en detektoruppsättning. I SOFISM beräknas korrelationer av intensiteter detekterade av flera detektorer. I princip, mätningen av n:te ordningens korrelation kan leda till en förbättring av upplösningsfaktorn 2n med avseende på diffraktionsgränsen. I praktiken, upplösningen som kan uppnås för högre ordningens korrelationer begränsas av signal-brusförhållandet för mätningarna.

"SOFISM är en kompromiss mellan användarvänlighet och upplösning. Vi tror att vår metod kommer att fylla nischen mellan komplexet, svåranvända tekniker som ger mycket hög upplösning och de lättanvända metoderna med lägre upplösning. SOFISM har ingen teoretisk upplösningsgräns, och i vår artikel, vi visar resultat som är fyra gånger bättre än diffraktionsgränsen. Vi visar också att SOFISM-metoden har en hög potential vid avbildning av tredimensionella biologiska strukturer, " sa Dr Radek Lapkiewicz.

Avgörande, SOFISM är, i sina tekniska aspekter, mycket tillgänglig, eftersom det bara kräver att man introducerar en liten modifiering av det allmänt använda konfokalmikroskopet – att ersätta dess fotomultiplikatorrör med en SPAD-arraydetektor. Dessutom, det är nödvändigt att öka mättiden något och ändra databehandlingsproceduren. "Tills nyligen, SPAD-arraydetektorer var dyra och deras specifikationer var inte tillräckliga för korrelationsbaserad mikroskopi. Denna situation har nyligen förändrats. De nya SPAD-detektorerna som introducerades förra året tog bort både de tekniska och prisrelaterade hindren. Detta får oss att tro att fluorescensmikroskopitekniker som SOFISM kan, om några år, bli allmänt använd inom området för mikroskopisk undersökning, " betonade Dr Lapkiewicz.