(Phys.org) - Forskare från Georgia Institute of Technology och University of California San Francisco har avancerade vetenskapsmäns förmåga att se en tydlig bild av en enda cellulär struktur i rörelse. Genom att identifiera molekyler med hjälp av komprimerad avkänning, denna nya metod ger nödvändig rumslig upplösning plus en snabbare tidsupplösning än tidigare möjligt.

Trots många framsteg inom området superupplösningsmikroskopi under de senaste åren med framsteg i rumslig upplösning, live-cell imaging har förblivit en utmaning på grund av behovet av hög tidsupplösning.

Nu, Lei Zhu, biträdande professor vid Georgia Techs George W. Woodruff School of Mechanical Engineering, och Bo Huang, biträdande professor vid UCSF:s institution för farmaceutisk kemi och institution för biokemi och biofysik, har utvecklat ett avancerat tillvägagångssätt med hjälp av superupplösningsmikroskopi för att lösa cellulära särdrag en storleksordning mindre än vad som kunde ses tidigare. Detta gör att forskarna kan ta del av tidigare otillgänglig information och svara på nya biologiska frågor.

Forskningen publicerades den 22 april, 2012 i tidningen Naturmetoder . Forskningen finansieras av National Institutes of Health, UCSF-program för banbrytande biomedicinsk forskning, Searle Scholarship och Packard Fellowship for Science and Engineering.

Den tidigare tekniken som använder enkelmolekylväxlingsmetod för superupplösningsmikroskopi beror på att enstaka molekylbilder sprids sparsamt till många, ofta tusentals, kameraramar. Den är extremt begränsad i sin tidsmässiga upplösning och ger inte förmågan att följa dynamiska processer i levande celler.

"Vi kan nu använda vår upptäckt med hjälp av superupplösningsmikroskopi med sekunder eller till och med undersekunders temporal upplösning för ett stort synfält för att följa många fler dynamiska cellulära processer, " sa Zhu. "Mycket av vår kunskap om en cells liv kommer från vår förmåga att se de små strukturerna i den."

Huang noterade, "En ansökan, till exempel, är att undersöka hur mitokondrier, cellens krafthus, interagerar med andra organeller och cytoskelettet för att omforma strukturen under cellens livscykel."

För närvarande, ljusmikroskopi, speciellt i den moderna formen av fluorescensmikroskopi, används fortfarande ofta av många biologer. Dock, författarna säger, konventionell ljusmikroskopi har en stor begränsning:oförmågan att lösa upp två objekt närmare än halva ljusets våglängd på grund av det fenomen som kallas diffraktion. Med diffraktion, bilderna ser suddiga och överlappade ut oavsett hur hög förstoring som används.

"Diffraktionsgränsen har länge betraktats som en av de grundläggande begränsningarna för ljusmikroskopi fram till de senaste uppfinningarna av superupplösningsfluorescensmikroskopitekniker, " sa Zhu. Superupplösningsmikroskopimetoder, såsom stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM) eller fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM), förlita sig på förmågan att registrera ljusemission från en enda molekyl i provet.

Med hjälp av sondmolekyler som kan växlas mellan ett synligt och ett osynligt tillstånd, STORM/PALM bestämmer positionen för varje molekyl av intresse. Dessa positioner definierar i slutändan en struktur.

Det nya fyndet är betydande, sa Zhu och Huang, eftersom de har visat att tekniken gör det möjligt att följa dynamiken i ett mikrotubuli-cytoskelett med en tre sekunders tidsupplösning, vilket skulle göra det möjligt för forskare att studera de aktiva transporterna av vesikler och andra laster inuti cellen.

Använder samma optiska system och detektor som i konventionell ljusmikroskopi, superupplösningsmikroskopi kräver naturligtvis längre insamlingstid för att få mer rumslig information, leder till en avvägning mellan dess rumsliga och tidsmässiga upplösning. I superupplösningsmikroskopimetoder baserade på STORM/PALM, varje kamerabild samplar en mycket gles delmängd av sondmolekyler i provet.

Ett alternativt tillvägagångssätt är att öka densiteten av aktiverade fluoroforer så att varje kameraram tar prov på fler molekyler. Dock, denna höga täthet av fluorescerande fläckar gör att de överlappar varandra, ogiltigförklarande av den allmänt använda metoden för lokalisering av en molekyl.

Författarna sa att ett antal metoder har rapporterats nyligen som effektivt kan hämta positioner med en molekyl även när de enskilda fluoroforsignalerna överlappar varandra. Dessa metoder är baserade på att passa kluster av överlappande fläckar med ett variabelt antal punktspridningsfunktioner (PSF) med antingen maximal sannolikhetsuppskattning eller Bayesiansk statistik. Den Bayesianska metoden har också tillämpats på hela bilduppsättningen.

Som ett resultat av ny forskning, Zhu och Huang presenterar ett nytt tillvägagångssätt baserat på global optimering med hjälp av komprimerad avkänning, vilket inte innebär att uppskatta eller anta antalet molekyler i bilden. De visar att komprimerad avkänning kan fungera med mycket högre molekyldensiteter jämfört med andra teknologier och visar levande cellavbildning av fluorescerande proteinmärkta mikrotubuli med tre sekunders tidsupplösning.

STORM-experimentet som används av författarna, med immunfärgade mikrotubuli i Drosophila melanogaster S2-celler, visat att närliggande mikrotubuli kan lösas genom komprimerad avkänning med så få som 100 kameraramar, medan de inte kunde urskiljas med en molekylpassningsmetoden. De har också utfört levande STORM på S2-celler som stabilt uttrycker tubulin fuserat till mEos2.

Med den vanliga kamerans bildfrekvens på 56,4 Hertz, en film med superupplösning konstruerades med en tidsupplösning på tre sekunder (169 bilder) och en Nyquist-upplösning på 60 nanometer, mycket snabbare än tidigare rapporterat, sa Zhu och Huang. Dessa resultat har bevisat att komprimerad avkänning kan göra det möjligt för STORM att övervaka levande cellulära processer med tidsupplösning i andra skala, eller till och med en upplösning i undersekund om en snabbare kamera kan användas.