Molekylär kloning är en vanlig bioteknikmetod som varje student och forskare bör känna till. Molekylär kloning med användning av en typ av enzym som kallas ett restriktionsenzym för att skära humant DNA i fragment som sedan kan sättas in i plasmid-DNA från en bakteriecell. Restriktionsenzymer skar dubbelsträngat DNA i hälften. Beroende på restriktionsenzym kan skäret resultera i antingen en klibbig ände eller en trubbig ände. Klibbiga ändar är mer användbara vid molekylkloning eftersom de säkerställer att det mänskliga DNA-fragmentet införs i plasmiden i rätt riktning. Ligeringsprocessen, eller sammansmältning av DNA-fragment, kräver mindre DNA när DNA har klibbiga ändar. Slutligen kan flera klibbiga ändrestriktionsenzymer producera samma klibbiga ände, även om varje enzym känner igen en annan restriktionssekvens. Detta ökar sannolikheten för att din DNA-region av intresse kan klippas ut med klibbiga enzymer.
Restriction Enzymer and Restriction Sites -
Restriction enzymer är enzymer som skär igenkänner specifika sekvenser på dubbelsträngat DNA och skär DNA i halva vid den sekvensen. Den igenkända sekvensen kallas restriktionsstället. Restriktionsenzymer kallas endonukleaser eftersom de skär kapsel med dubbelsträngat DNA, vilket är hur DNA normalt finns, på platser som är i mellan DNA-ändarna. Det finns mer än 90 olika restriktionsenzymer. Var och en känner igen en särskild begränsningssida. Restriktionsenzymer klyver sina respektive restriktionsplatser 5 000 gånger mer effektivt än andra platser som de inte känner igen.
The Right Orientation -
Restriction enzymer finns i två allmänna klasser. De skär antingen DNA i klibbiga ändar eller trubbiga ändar. En klibbig ände har en kort region av nukleotider, byggstenarna för DNA, som är oparade. Denna orörda region kallas ett överhäng. Överhänget sägs vara klibbigt eftersom det vill och kommer att para ihop med en annan klibbig ände som har komplementär överhängssekvens. Klibbiga ändar är som långförlorade tvillingar som försöker krama varandra tätt när de möts. Å andra sidan är trubbiga ändar inte klibbiga eftersom alla nukleotider redan är parade mellan de två DNA-strängarna. Fördelen med klibbiga ändar är att ett fragment av humant DNA endast kan passa in i en bakterieplasmid i en riktning. Däremot, om både mänskligt DNA och bakteriell plasmid har trubbiga ändar, kan det mänskliga DNA infogas head-to-tail eller tail-to-head i plasmiden.
Ligating Sticky Ends Kräver mindre DNA
Även om DNA med stickändar har en enklare tid att hitta varandra på grund av deras "klibbighet", varken klibbiga ändar eller trubbiga ändar kan smälta samman till en kontinuerlig bit av DNA. Bildning av en kontinuerlig bit DNA som är helt kopplad kräver ett enzym som kallas ett ligas. Ligaser förbinder ryggraden i nukleotider vid de klibbiga eller trubbiga ändarna, vilket resulterar i en kontinuerlig kedja av nukleotider. Eftersom klibbiga ändar hittar varandra snabbare på grund av deras attraktion för varandra, kräver ligeringsprocessen mindre humant DNA och mindre plasmid-DNA. De trubbiga ändarna av DNA och plasmider är mindre benägna att hitta varandra, och därför kräver ligering av trubbiga ändar att mer DNA läggs i provröret.
Olika enzymer kan ge samma klibbiga slut |
Restriktion platser är belägna i hela organismernas genom, men är inte jämnt fördelade. I plasmider kan de konstrueras så att de är belägna bredvid varandra. Forskare som vill skära ut ett fragment av mänskligt DNA från det mänskliga genomet måste hitta restriktionsställen som ligger framför och bakom fragmentet. Förutom att säkerställa att ett DNA-fragment sätts i rätt riktning, kan olika klibbiga enzymer skapa samma klibbiga ände även om de känner igen olika restriktionssekvenser. Till exempel har BamHI, BglII och Sau3A olika igenkänningssekvenser men producerar samma GATC-klibbiga ände. Detta ökar sannolikheten för att det kommer att finnas platser med klibbiga ändbegränsningar som flankerar din mänskliga gen av intresse.
