Under två veckor 2004, Song Zhiwei bevittnade den långsamma döden av en koloni av celler. Låt, en bioingenjör vid A*STAR Bioprocessing Technology Institute (BTI), hade badat en platta med äggstocksceller från kinesisk hamster (CHO) med lektin, ett giftigt protein som härrör från växter. Han observerade sedan hur miljontals celler krympte till ett dussin överlevande. De såg genomsnittliga ut, men Song visste att de hade superkrafter. Hemligheten gömdes i sötningen.

Socker är nödvändigt för livet. Bland de viktigaste klassen av sockerarter är de som är kemiskt bundna till proteiner. Dessa glykoproteiner är involverade i allt från att känna igen immunsystemets inkräktare till att smörja membran och stimulera sköldkörteln. De driver också en blomstrande läkemedelsindustri – många hushållsläkemedel innehåller glykoproteiner, och bioteknikföretag investerar betydande resurser i att optimera sockringen av dessa proteiner för att förbättra deras bioaktivitet och terapeutiska styrka.

Lektin är känt för att binda till sockerarter som dinglar i ändarna av glykoproteiner. I Songs experiment, endast mutanta CHO-celler som inte producerade dessa bindande sockerarter kunde överleva lektinbehandlingen. Detta tillvägagångssätt att "se vad som fastnar" är en etablerad metod för att identifiera mutanter som sedan kan massproduceras av bioteknikindustrin.

Song tillbringade de kommande två åren med att genomföra cellodlingsexperiment, molekylärbiologiska studier och genetiska tester för att bevisa att cellerna faktiskt var mutanter. Att bestämma den exakta strukturen av mutantglykoproteinerna krävde hjälp från hans kollega Lee May May, som ledde analysgruppen på BTI. May använde masspektrometriverktyg för att bestämma den exakta biokemiska strukturen av proteinerna som produceras av Songs mutantceller, avslöjar att de saknade nyckelsocker. Song hade skapat de första sockermuterade cellinjerna som är tillämpliga på bioteknisk tillverkning.

Samarbetet har sedan dess expanderat till ett globalt välkänt partnerskap mellan bioingenjörer och bioanalytiker på A*STAR, öka förståelsen för sockerarternas roll i sjukdomar.

Smicker

Socker är den minsta och enklaste formen av kolhydrater, gjorda av enkla eller sammankopplade molekylenheter av kol, väte och syre. Vårt blod innehåller hundratals typer av sockerarter:vissa flyter fritt, men många fler fäster vid proteiner som dekorationer på en julgran. Nästan 70 procent av proteinerna i vår kropp är glykosylerade, vilket betyder att de inte kommer att fungera utan deras söta utrustning. Det specifika arrangemanget av socker, eller glykaner, på ett glykoprotein bestämmer hur ett protein viker sig och interagerar med andra molekyler, ändrar dess löslighet och ibland till och med de meddelanden den sänder till celler. "Cellen förbrukar en enorm mängd energi för att lägga socker på proteiner, säger Pauline Rudd, en veteran inom området glykobiologi, som gick med i BTI-analysteamet 2015. "Om du inte hade socker, du skulle inte överleva."

Forskare upptäckte först den kritiska rollen av glykoproteiner i början av 1900-talet. En österrikisk läkare, Karl Landsteiner, märkte att människoblod blandas med blod från djur, eller till och med andra människor, bildar klumpar. Dessa klumpar kan täppa till kärl eller spricka upp för att frigöra giftiga proteiner i kroppen. Dock, Landsteiner märkte att vissa blandningar inte koagulerade. Denna upptäckt ledde honom till den blodgruppsklassificering som fortfarande används idag - A, B, AB och O – och vann honom Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1930. På 1950-talet fastställde forskare att sockerarterna som exponerades på ytan av röda blodkroppar avgjorde vilken blodgrupp de tillhörde.

Blodarbetet uppmuntrade forskning om glykoproteiner. På 1990-talet, biologer fastnade i genetikvurmen. Botemedlet mot allt, de ställde sig, var gömd i vårt DNA. "Gener påstods vara orsaken till allt, säger Rudd, som såg finansieringen av glykobiologin minska. Mellan 1998 och 2000, 3,5 miljarder dollar spenderades globalt på genomikforskning, inklusive initiativet att sekvensera hela det mänskliga genomet. "Det fanns mycket information men det gav oss inte en direkt väg till att förstå sjukdom, " säger Rudd. "Folk började antyda att gener kanske inte gör någonting förutom kodning för proteiner."

Forskare flyttade sin uppmärksamhet till de många andra stadierna av biologisk aktivitet tills de åter kom fram till sockerarter.

"DNA är det första lagret av information. Denna information transkriberas till RNA, som skickar ett meddelande som översätts till ett protein med en funktion, " säger Song. "Kolhydrater, eller socker, är det sista lagret av biologisk information."

Att veta vikten av socker gjorde dem inte lättare att studera. DNA och proteiner är i huvudsak linjära strukturer som "kurar ihop sig till snygga former, " säger Rudd. Sockerarter förgrenar sig i flera kedjor. "De är som stora träd som hänger utanför sidorna av proteiner." Det skulle ta flera år innan sockerarter kunde analyseras med precisionen och hastigheten hos gener och proteiner.

Skaka upp

1989 drabbade en jordbävning Kalifornien. Rudd minns det väl. Hon var djupt inne i ett samarbete mellan Oxford Glycobiology Institute (ledd av direktör Raymond Dwek) och ett forskarlag i London, letar efter förändringar i hur proteiner glykosyleras hos patienter med autoimmuna sjukdomar. Hon analyserade 600 prover av immunglobulin G (IgG) protein, använd en speciell gel för att filtrera sockerarterna. Fabriken som tillverkade denna gel förstördes av jordbävningen.

När fabriken byggdes om, dess gel var inte densamma. "Det var helt värdelöst, " minns Rudd. "Jag höll på att slita mig i håret när jag försökte få dessa 600 prover analyserade."

Nödvändighet föder uppfinning, så Rudd såg sig omkring och lade märke till kolumnerna för vätskekromatografi (LC) hon hade använt för att sortera proteiner. Hon stack in en spruta fylld med en blandning av sockerarter som frigjorts från hennes glykoproteinprover i kolumnerna. LC-anordningen filtrerade sockerarterna till en mycket högre upplösning än gelprocessen. "Vi gick aldrig tillbaka, " hon säger.

Sedan dess, Rudd har samarbetat med privata och institutionella partners för att påskynda, automatisera och förbättra specificiteten hos tekniker för att sortera och karakterisera sockerarter från ett prov. Det som förr tog ett år kan nu göras på en dag. Arbetsflödet, bioinformatik och databaser utvecklade av Rudds team vid National Institute for Bioprocessing Research and Training (Dublin, Ireland) har införlivats i Waters Corporations UNIFI analytisk kopplad vätskekromatografi/masspektrometriplattform, vilket innebär att mycket av komplexiteten i glykoanalys nu är automatiserad. Därav, glykoanalys har gått in i en ny era av glykomik, föra det närmare genetikens stora datauniversum, transkriptomik och proteomik.

"Vi kan nu titta på stora kohorter av prover för att förstå mer om sjukdomar och för att stödja biologisk utveckling och produktion, " säger Terry Nguyen-Khuong, som leder analysgruppen på BTI. Sedan han slog sig ihop med Rudd, A*STAR har utökat sin analysportfölj för att zooma in på sockerarter och identifiera deras exakta plats, grundläggande byggstenar och länkande strukturer.

Pharming glykoproteiner

Glykoproteiner driver en biofarmakaindustri på 163 miljarder USD av läkemedel vars effektivitet kan dikteras av sockerarter. Till exempel, när hormonet erytropoietin är utsmyckat med sialinsyrasocker, det är tio gånger effektivare för att stimulera produktionen av röda blodkroppar hos anemiska patienter än bara hormonet.

I glykoproteinbranschen, CHO-celler omfattar hela arbetsstyrkan. De kan producera alla proteiner som bioteknikindustrin efterfrågar, och kan sockerbelägga proteinerna på samma sätt som människor gör.

Innan Song skapade sina första CHO-cellmutanter, ingen hade kunnat kontrollera glykosyleringen av proteiner i massproducerbara cellinjer. Pamela Stanleys grupp i USA hade justerat glykosyleringen av CHO-celler i flera år med hjälp av cellinjer som levde och dog på en platt petriskål, matas på proteinrikt koblod. Song utvecklade istället mutanter med hjälp av celler som han visste kunde replikera på obestämd tid medan de virvlade i sfäriska 20, 000-liters bioreaktorer som används i biofarmafabriker – fria från bovina tillsatser.

Han döpte cellinjen CHO-glykosyleringsmutant 1 (GMT-1), och sedan dess, mer än tjugo efterträdare har följt efter i nummerordning. När verktyg dök upp som gjorde det så enkelt att redigera gener som att klippa och klistra in ord på en datorskärm, han använde dem för att generera fler mutanter.

I GMT-3, han raderade en gen som krävs för att fixera fukosocker till proteiner. GMT-9 glykoproteiner saknar sockerarterna fukos och galaktos; och GMT-17 saknar fukos, galaktos och sialinsyra. Frånvaron av dessa sockerarter kan diktera drogens styrka. Songs celler producerar antikroppar som är upp till hundra gånger bättre på att döda cancerceller än motsvarande läkemedel på marknaden, såsom rituximab (märkt Rituxan) för att behandla leukemi. "Cellinjerna är jämförbara med industriella linjer och är redo för kommersialisering, säger Song, som har förvaltat ett glykomikbidrag på 11 miljoner S$ som heter GlycoSing sedan 2014. Behandlingar med dessa förbättrade antikroppar skulle innebära avsevärt reducerade doser.

2008, Andre Choo, en forskare vid BTI, utvecklade de första antikropparna som specifikt kunde döda embryonala stamceller, lindra oro för att cellerna bildar tumörer hos transplanterade patienter. Antikropparna har sedan dess licensierats till flera företag.

Många sjukdomar har en distinkt sockerprofil, ett koncept som Choo har börjat utnyttja för cancerterapi. Han screenar efter antikroppar som specifikt riktar sig mot avvikande sockermolekyler på ytan av cancerceller, arbetar med Rudd och Nguyen-Khuongs team för att analysera dem.

Nyligen i år, hans team skapade en antikropp som känner igen sockerarter som uttrycks på äggstockscancerceller. "Tidigare skulle vi generera en antikropp utan att riktigt veta vad den riktade sig mot, vi är nu fokuserade på att försöka få dessa antiglykanantikroppar."

På A*STAR, forskning har expanderat till dengue, Zikaviruset och hjärtsjukdomar. "Alla huvudområden inom medicin - cancer, infektionssjukdomar och inflammatoriska problem - är relaterade till glykoproteiner, säger Song, vars mutanter potentiellt skulle kunna bota dessa sjukdomar.