LMU:s Ralf Jungmann utvecklar mikroskopimetoder som kan lösa cellulära strukturer med dimensioner i storleksordningen nanometer. Han har nu lyckats avbilda aktinnätverk i celler mer detaljerat än tidigare.

Ralf Jungmann, Professor i experimentell fysik vid LMU och chef för forskargruppen Molecular Imaging and Bionanotechnology vid Max Planck Institute of Biochemistry (Martinsried), är engagerad i utvecklingen av innovativa metoder för mikroskopi som gör det möjligt att visualisera intracellulära processer på singelmolekylnivå. Hans tillvägagångssätt är baserat på användningen av fluorescerande markörer taggade med korta enkelsträngade DNA som definierar deras bindningsspecificitet. Dessa markörer känner igen sina mål genom att binda till komplementära DNA-sekvenser fästa till antikroppar som interagerar specifikt med individuella cellulära proteiner. Denna strategi, passande känt som DNA-PAINT, tillåter en att specifikt "adressera" en uppsjö av cellulära proteiner på en gång. Nu, ett team ledd av Jungmann, med Thomas Schlichthärle som första författare, rapporterar den första användningen av små proteiner som kallas 'affimers, "i stället för de skrymmande antikropparna, att visualisera aktinnätverken i celler med ännu högre upplösning. Arbetet utfördes i samarbete med grupperna ledda av Darren Tomlinson och Michelle Peckham vid University of Leeds samt Jonas Ries från European Molecular Biology Lab (EMBL) i Heidelberg. Den nya studien visas i tidskriften Angewandte Chemie .

Målet med superupplösningsmikroskopi är att visualisera cellulära strukturer och processer på enkelmolekylnivå, med molekyler som bara är några få nanometer stora. Antikropparna som hittills använts för att detektera cellulära proteiner är ganska stora – tre till fyra gånger större än de proteiner som de binder till. Detta gäller även för de DNA-märkta antikroppar som används för att visualisera målproteiner i experiment med DNA-PAINT. Skillnaden mellan upplösningen som tillhandahålls av DNA-PAINT och dimensionerna av antikropp-målkomplexet betyder i huvudsak att den fluorescerande signalen indikerar antikroppens position och inte den för proteinet till vilken den är bunden. Detta problem kan lösas och mer exakta och informativa data kan erhållas genom att utveckla mindre markörer som erbjuder samma nivå av igenkänningsspecificitet.

I deras senaste projekt, Jungmann och hans kollegor har vänt sig till affimers för detta ändamål. Affimerer är proteinbindare som är tio gånger mindre än traditionella antikroppar, men är fortfarande kapabla att specifikt känna igen och binda till definierade proteinarter. De produceras och visas på ytan av bakteriella virus, och kan lätt identifieras och renas. Genom att modifiera dessa affimerer genom platsspecifik fästning av en DNA-sträng med definierad sekvens, forskarna kunde tydligt visualisera enskilda aktinfilament i celler i tre dimensioner med hjälp av DNA-PAINT. Tills nu, detta har krävt användningen av extremt utarbetade mikroskopitekniker och högt specialiserade markörer. Genom att kombinera DNA-PAINT med dessa nya affimerer, det är nu möjligt att uppnå denna upplösningsnivå med en standardmikroskopinställning och reagens som är lätta att producera, säger Thomas Schlichthärle. Och Ralf Jungmann tillägger:Eftersom affimerreagens riktade mot olika proteiner är relativt lätta att göra i provröret, det borde vara möjligt i framtiden att använda dem för att märka stora uppsättningar proteiner i celler. I kombination med DNA-PAINT, Detta skulle tillåta oss att visualisera kompletta signalvägar som involverar hundratals olika proteinarter."