I en förlängning av forskning som publicerades för en månad sedan i Naturmetoder , en ny hybridmetod utförd av forskare från Clemson Universitys avdelning för fysik och astronomi och Stony Brook University har avslöjat en 3D-struktur av ett proteinfragment som kan fungera som ett läkemedelsmål vid behandling av strokepatienter.

Proteinet som kallas "postsynaptiskt densitetsprotein på 95 kDa (PSD-95)" är placerat på neuroner i hjärnan som tar emot kemiska meddelanden-neurotransmittorer-från intilliggande neuroner. Genom att rekrytera receptorer och andra hjälparproteiner, PSD-95 arbetar för att upprätthålla integriteten hos neurala anslutningar över tid, vilket underlättar neural kommunikation, inlärning och minne.

PSD-95 består av fem delar, eller domäner, att var och en spelar en annan roll i proteinets övergripande funktion. Två av dessa domäner, kallas PDZ-1 och PDZ-2, har visat sig påverka symptom i samband med ischemisk stroke, såsom förlamning eller talstörning.

"En av de idéer som har postulerats i litteraturen är att skapa ett multivalent läkemedel som riktar sig till båda PDZ -domänerna eftersom de är väldigt lika i naturen. Om du kan blockera PDZ -domänerna från att binda specifika proteiner eller enzymer, du kan minska de försvagande effekterna av en stroke, "sa Hugo Sanabria, huvudförfattare på studien.

Utmaningen, dock, är att det är nästan omöjligt att designa en läkemedelshämmare utan att först veta den exakta strukturen för PDZ-domänerna i PSD-95. Det skulle vara som att köra över landet utan att ha en karta över USA.

"Biomolekylernas biologiska funktioner bestäms av deras strukturer, så vi behöver detaljerade strukturella och dynamiska insikter om PDZ -1 och -2 för att bättre förstå deras funktionella roller och stöd i utformningen av nya hämmare, "sa Feng Ding, Sanabrias kollega här på Clemson.

Det finns en handfull metoder för att återge strukturen för biomolekyler. Men när det gäller PSD-95, varje tillvägagångssätt - NMR -spektroskopi, Röntgenkristallografi och Förster resonans energiöverföring (FRET) - levererade en annan strukturell modell. Forskarnas samarbetspartner vid Stony Brook University, docent Mark Bowen vid institutionen för fysiologi och biofysik, etablerade ett partnerskap med Sanabria om detta projekt efter att han avslöjat en av de inkonsekventa strukturella modellerna för PSD-95-fragmentet.

Sanabrias laboratorium hanterade denna skillnad genom att först modellera PSD-95-fragmentet med FRET, ett tillvägagångssätt som identifierar möjliga konfigurationer av biomolekyler. Enligt denna metod, Sanabria fäste två ljuskänsliga molekyler, kallas kromoforer, på två olika positioner på PSD-95-fragmentet. Han avslöjade sedan avståndet mellan kromoforerna genom att visualisera fragmentet under ett mikroskop. Detta upprepades flera gånger från olika fästpunkter.

"För modelleringsaspekten, FRET ger dig avstånd mellan kromoforer, men det räcker inte för att fylla alla molekylens geometriska begränsningar, så vi måste lita på något annat, någon annan metodik. Det är där professor Ding spelar in, "Sa Sanabria.

Ding leder ett beräkningsbiologiskt laboratorium vid Clemson University där han använder datorprogram för att mäta hur biomolekyler ser ut, flytta och fungera. Hans tillvägagångssätt för modellering använder en datasimulering som kallas diskret molekylär dynamik (DMD) som kartlägger landskapet i en biomolekyl, förutsäga proteinernas banor när de viks och interagerar med andra molekyler. Den efterföljande simuleringen kan spelas upp som en film, hjälpa forskare att visualisera proteinbeteenden över tid.

"Om du gör traditionella molekylära simuleringar, vanligtvis kommer du att prova en mycket liten del av utrymmet, särskilt för större molekyler, så du kommer inte att ha en bra överblick över hur hela molekylen kommer att se ut även under fysiologiska förhållanden, "Sanabria sa." Diskret molekylär dynamik är ett mycket snabbare och mindre beräkningsmässigt dyrt sätt att exakt och snabbt prova proteinets konformationsutrymme. "

Att göra det, Sanabria erhöll först en uppsättning avstånd genom att mäta PSD-95 med FRET. I det experimentet, Sanabria hade 10 prover av PSD-95-fragmentet som var och en gav olika avstånd och tre vanliga former-eller konformationer-av PSD-95 observerades. Än, utan DMD -simulering, det fanns inget sätt för forskarna att veta vilket avstånd som motsvarade vilken konformation av fragmentet. Så de matar in varje möjligt avstånd mot varje möjlig form och låter simuleringen göra resten.

"När vi väl gjorde den första simuleringen, vi såg att det fanns tre huvudtillstånd som PDZ -1 och -2 tog. En visade mycket nära kontakt mellan de två, en visade en uppsättning mellanliggande kontakt och en hade ingen som helst kontakt, "Sa Ding.

Forskarna körde sedan en DMD -simulering igen utan att överväga FRET -avstånden för att bekräfta att de tre observerade tillstånden finns i naturen och inte bara är en lycka som FRET -avstånden påtvingar. De undersökte strukturerna ytterligare genom att titta på hur enskilda aminosyror, som utgör PDZ -domänerna, binda till varandra. Från dessa analyser, Ding, Bowen och Sanabria kunde bekräfta att PDZ -domänerna tar två av de tre observerade tillstånden i DMD -simuleringen - det med viss kontakt och det utan någon som helst kontakt.

"Nu, vi har två potentiella mål för att konstruera nya läkemedel som kommer att vara mer effektiva än de som för närvarande finns tillgängliga, "Sanabria sa." Utsikterna för stroke patienter är lovande. "

Utan diskret molekylär dynamik, som kan fånga konformationsförändringar som inträffar på mikrosekundens tidsskala, dessa två stater skulle ha missats som i tidigare studier.

"De flesta som gör FRET-guidad strukturell modellering arbetar med en stel molekyl, som DNA. Om du har en stel molekyl, det är lätt att modellera - du har bara ett enda tillstånd att fånga. Du kan tilldela FRET -avstånden och det är verkligen inga problem, "Sa Sanabria." I det här fallet, vi överträffade detta tillvägagångssätt på många sätt. "

I framtida studier, laget vill analysera potentialen för PSD-95-fragmentet att automatiskt hämma sig själv baserat på fragmentets egen struktur.