Konstruktion av glykolyl-CoA-karboxylas (GCC), nyckelenzymet i TaCo-vägen. GCC utvecklades på ställningen av ett naturligt förekommande propionyl-CoA-karboxylas (WT). Rationell design ledde till den 50 gånger förbättrade versionen M3, och ytterligare screening med hög genomströmning möjliggjorde identifieringen av en 900 gånger förbättrad version (M5). Kredit:Max Planck Institute for terrestrial Microbiology/Scheffen
Fotorespiration är en mycket energikrävande process i växter som leder till frisättning av tidigare fixerad CO 2 . Således, att konstruera denna metaboliska process är en nyckelmetod för att förbättra skörden och för att möta utmaningen med ständigt stigande koldioxid 2 nivåer i atmosfären. Forskare under ledning av Tobias Erb från Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology i Marburg, Tyskland, har nu lyckats konstruera TaCo-vägen, en syntetisk fotorespiratorisk bypass. Denna nya metaboliska koppling öppnar nya möjligheter för CO 2 fixering och framställning av förädlade föreningar.
Allt liv är beroende av fixering av CO 2 genom växter. Dock, enzymatisk effektivitet av naturlig fotosyntes är begränsad, sätta en gräns för jordbrukets produktivitet och CO 2 fixering. Fotorespiration är en avgiftningsprocess i växter som återvinner en giftig biprodukt från fotosyntesen, 2-fosfoglykolat. Fotorespiration är mycket energikrävande och leder till frisättning av tidigare fixerad CO 2 , därmed ytterligare bromsa den fotosyntetiska balansen.
Forskare under ledning av Tobias Erb från Max Planck Institute for terrestrial Microbiology har utvecklat en syntetisk fotorespiratorisk bypass som representerar ett alternativ till naturlig fotorespiration. I samarbete med gruppen Arren Bar-Even (Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, Potsdam-Golm), och inom det EU-finansierade projektet Future Agriculture, teamet har designat den så kallade tartronyl-CoA (TaCo)-vägen som är mycket kortare än naturlig fotorespiration och kräver endast 5 istället för 11 enzymer. Den kanske största fördelen med TaCo-vägen är att den fixar CO 2 istället för att släppa den, som det händer i naturlig fotorespiration. Som ett resultat, TaCo-vägen är mer energieffektiv än någon annan föreslagen fotorespiratorisk bypass hittills.
Att bygga TaCo-vägen var en vetenskaplig resa som har lett forskarna från beräkningsmodell till enzymteknik, mikrofluidisk screening med hög genomströmning, kryo-EM-teknik mot en framgångsrik in vitro-implementering av en ny till naturen metabolisk koppling som öppnar upp nya möjligheter för CO 2 fixering och framställning av förädlade föreningar. "Den största utmaningen med att förverkliga TaCo-vägen var att hitta alla nödvändiga enzymer, " Marieke Scheffen, Postdoktor i Tobias Erbs grupp och huvudförfattare till studien, minns. "Det innebar att vi var tvungna att leta efter enzymer som utför liknande reaktioner och sedan 'lära' dem att utföra den önskade reaktionen."
Effektivare enzymer
För TaCo-vägen, initialt hittades en handfull enzymer som kunde katalysera de nödvändiga reaktionerna. Dock, de visade låg katalytisk effektivitet, vilket betyder att de var ganska långsamma jämfört med naturligt förekommande enzymer. Forskarna syftade till att öka framför allt prestandan hos nyckelenzymet i TaCo-vägen, glykolyl-CoA-karboxylas (GCC), katalysatorn som gör fotorespiration kolpositiv.
Som en grund för att skapa ett syntetiskt glykolyl-CoA-karboxylas (GCC) utvecklade forskarna en molekylär modell av enzymet. Olika varianter av enzymet skapades baserat på ett naturligt förekommande propionyl-CoA-karboxylas, som vanligtvis är involverad i fettsyrametabolismen, som en ställning genom att utbyta aminosyrarester. Denna rationella designstrategi ledde till en 50-faldig förbättring av enzymets katalytiska effektivitet med glykolyl-CoA.
För att driva enzymets prestanda ytterligare, forskarna slog sig ihop med gruppen av Jean-Christophe Baret från det franska nationella centret för vetenskaplig forskning (CNRS, CRPP) Bordeaux, Frankrike, med vilken de utvecklade en mikroflödesskärm med ultrahög kapacitet och screenade tusentals syntetiska varianter. Inom två omgångar av efterföljande mikroplattscreeningar, en enzymvariant upptäcktes som visade en till och med nästan 900 gånger ökad katalytisk effektivitet med glykolyl-CoA. "Med denna katalytiska effektivitet, GCC är i intervallet av naturligt förekommande biotinberoende karboxylaser. Detta betyder att vi kunde konstruera ett enzym från nästan ingen aktivitet mot glykolyl-CoA till mycket hög aktivitet, som är jämförbar med naturligt utvecklade enzymer, " förklarar Marieke Scheffen.
Högupplöst elektronmikroskopi
Att lösa den molekylära strukturen för denna nyutvecklade katalysator uppnåddes i ytterligare ett samarbete, med Jan och Sandra Schuller från Max Planck Institute of Biochemistry, Martinsried (nuvarande SYNMIKRO i Marburg). Forskarna tillämpade banbrytande kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) med en atomupplösning på 1,96 Å, tänjer alltså på gränserna för cryo-EM.
Till sist, det syntetiska GCC-enzymet visade sig fungera i in vitro-experiment i kombination med de två andra enzymerna i TaCo-vägen, bildar således en användbar kolfixeringsväg. "TaCo-vägen är inte bara ett lovande alternativ för fotorespiration", säger gruppledare Tobias Erb. "Vi kan också visa att det kan kopplas samman med annan syntetisk CO 2 fixeringscykler, som CETCH-cykeln. Nu kommer vi att effektivt kunna koppla samman syntetisk CO 2 fixering direkt till central metabolism."
Detta öppnar upp en rad vetenskapliga möjligheter, till exempel mot återvinning av polyetylentereftalat (PET). TaCo-vägen skulle kunna användas för att omvandla etylenglykol (en monomer av PET) direkt till glycerat, göra det användbart för produktion av biomassa eller förädlade föreningar. Nästa steg kommer att vara att främja in vivo-implementeringen, för att utnyttja den fulla potentialen hos den nyutvecklade vägen.
