Forskare från Kobe University har framgångsrikt utvecklat ett tyrosinchassi (en mikroorganismstam med hög tyrosinproduktivitet) i jästen Pichia pastoris genom rationell ingenjörskonst. Dessutom använde de detta tyrosinchassi för att utveckla smarta celler som kan producera de växtbaserade föreningarna resveratrol, naringenin, norkoklaurin respektive retikulin. Dessa föreningar har ett brett användningsområde; till exempel används de för att tillföra näring till livsmedel och som råvaror för läkemedel. Förhoppningen är att detta tyrosinchassi kan användas som utgångspunkt för högutbytesbiosyntes av olika användbara föreningar och generiska kemikalier.

Denna studie från Kobe University genomfördes av en forskargrupp som inkluderade Ph.D. student Kumokita Ryota (Forskarskolan för vetenskap, teknik och innovation) och professor Hasunuma Tomohisa (Engineering Biology Research Center).

Dessa forskningsresultat publicerades i den internationella vetenskapliga tidskriften ACS Synthetic Biology den 16 maj 2022.

Bioaktiva växtbaserade aromatiska föreningar som stilbenoider, flavonoider och bensylisokinolinalkaloider (BIA) produceras av tyrosin. Dessa föreningar har en mängd olika tillämpningar inom många industrier, inklusive kemisk produktion, livsmedels-, kosmetik- och läkemedelsindustri. Dessa aromatiska föreningar produceras för närvarande genom direkt extraktion från växter, men endast små mängder finns inuti växter och avkastningen beror mycket på väder och klimat. Det finns ingen stabil tillgång.

Under de senaste åren har framsteg inom syntetisk biologi lett till utvecklingen av tekniker för att producera användbara föreningar. Dessa tekniker drar fördel av mikroorganismernas förmåga att producera ämnen genom att introducera växthärledda metaboliska vägar i mikroorganismen så att den kommer att producera målföreningen. Av mikroorganismerna har jästsvampar uppmärksammats som värdar för sammansättningsproduktion eftersom de utmärker sig vid biosyntetisering av växtbaserade föreningar. Jästernas potential för att producera tyrosinhärledda föreningar var dock oklar eftersom få framgångar hade rapporterats.

I denna studie började forskarna med att skapa en jäststam som kunde producera höga utbyten av tyrosin. Med denna nya stam som utgångspunkt gjorde de förändringar i dess metabolism för att uppnå det ovannämnda målet att producera höga utbyten av olika användbara föreningar. Typen av jäst de fokuserade på var P. pastoris. P. pastoris förökar sig snabbt under aeroba förhållanden och producerar inte fermentativa biprodukter (etanol), vilket innebär att den har potential att producera höga utbyten av en målförening på kort tid. Emellertid hade inga studier rapporterat om att producera tyrosin-härledda föreningar i P. pastoris och det var inte känt vilka gener som skulle vara användbara för att producera höga skördar. Samtidigt som forskarna gjorde en enkel utvärdering av mängden producerat tyrosin, letade forskarna också efter gener som förbättrar tyrosinproduktionen. De utvärderade sedan P. pastoris potential för biosyntetisering av tyrosinhärledda användbara föreningar genom att introducera biosyntesvägar i jästen för var och en av följande:stilbenoiden resveratrol, flavonoiden naringenin och BIA:erna norkoklaurin och retikulin.

Först och främst försökte forskarna hitta gener i jäststammar som ökar produktionen av tyrosin. För att göra detta fokuserade de på betaxantin, som kan framställas från tyrosin i en trestegsreaktion (Figur 1).

Betaxanthin är ett gult pigment som avger grön fluorescens. Därför är det lätt att utvärdera styrkan av det metaboliska flödet till tyrosin genom att titta på fluorescensintensiteten och färgen. När forskarna skapade denna utvärderingsmetod upptäckte forskarna gener som förbättrade tyrosinproduktiviteten och använde denna kunskap för att framgångsrikt utveckla en stam av P. pastoris med hög tyrosinproduktivitet (Figur 2).

Forskarnas nästa mål var att förbättra produktionshastigheten för olika användbara tyrosinhärledda föreningar genom att modifiera metabolismen av den högproduktiva stammen. De lyckades avsevärt förbättra produktionen av resveratrol, naringenin och norkoklaurin genom att introducera specifika biosyntesvägar (Figur 1) för var och en, vilket avslöjar att P. pastoris kan producera höga utbyten av tyrosinhärledda föreningar (Figur 3).

Därefter analyserade forskargruppen ingående de intracellulära metaboliterna i den nya P. pastoris-stammen som de utvecklade och undersökte mekanismen för hög tyrosinproduktivitet. Resultaten avslöjade att ett stort antal metaboliter i shikimatvägen involverade i tyrosin- och tyrosinsyntes ackumulerades i den konstruerade stammen (Figur 4). Dessa resultat visar att modifiering av metabolismen framgångsrikt förbättrade det metaboliska flödet till tyrosin. Det finns framtida potential att ytterligare öka produktionen av användbara föreningar som kan biosyntetiseras från tyrosin genom att optimera metabolismen av shikimatvägen.

Slutligen siktade forskarna på att producera tyrosinhärledda föreningar via jäsning med råglycerol som tillväxtmedium. Råglycerol är en viktig avfallsbiprodukt från produktion av biodiesel (ett potentiellt alternativ till petrokemiskt bränsle). Forskargruppen använde vätskan (Figur 5, höger) som erhölls från neutralisering av råglycerol som ett tillväxtmedium i ett mikrobiellt produktionsexperiment. I detta experiment lyckades de producera samma mängder resveratrol, naringenin och norkoklaurin som när ren glycerol användes. Dessa resultat visar att P. pastoris inte bara kan producera användbara föreningar från ren glycerol utan också från rå glycerol.

Det tyrosinchassi som utvecklats genom denna forskning kan användas för fermentativ produktion av olika användbara föreningar och generiska kemikalier som kan biosyntetiseras från tyrosin. Dessutom hoppas forskarna att ytterligare öka produktionen av tyrosinhärledda föreningar genom att använda resultaten av metabolomanalysen av deras nya P. pastoris-stam som grund för optimering av metabola vägar. + Utforska vidare

Upptäckt av ett nytt fenomen som förändrar spelet för effektiv bioproduktion av användbara kemikalier