Figur 1. Ett integrerat tillvägagångssätt för HS-AFM och molekylär dockning för att avslöja bindningsmekanismen för Apt-7 till CYP24 (A) Den tredimensionella bilden av de topprankade dockade konformationerna av CYP24 och Apt-7. De förutsagda bindningsställena för Apt-7 visas med pil. Aptamer binder till substratbindningsstället för CYP24 (bindningsställe-1) och till ADX-bindningsstället för CYP24 (bindningsställe-2). (B) Jämförelse av pseudo-HS-AFM-grafiken för CYP24-Apt-7 med hjälp av molekylär dockningsgenererad topprankad ställning av CYP24-Apt-7-komplexet med realtidsbilder som tagits av HS-AFM. Kredit:Kanazawa University
Forskare vid Kanazawa University i samarbete med team från Toyama Prefectural University och BioSeeds Corporation rapporterar i ACS Applied Materials &Interfaces identifieringen av en molekyl med ökad antiproliferativ aktivitet i cancerceller. Den bakomliggande biomolekylära mekanismen är hämningen av ett enzym som överproduceras i flera typer av cancer.
Vitamin D3 har viktiga biologiska funktioner, inklusive att bibehålla bentätheten, vilket minimerar risken för benfraktur. Men vitamin D3 tros också ha anticanceraktivitet, eftersom låga vitamin D3-nivåer och den tillhörande överproduktionen av ett enzym som kallas CYP24 är kopplade till en dålig prognos för cancerpatienter. Molekyler som begränsar eller hämmar verkan av CYP24 och molekyler som efterliknar funktionen av vitamin D3 är numera mycket undersökta som potentiella antiproliferativa medel för cancerbehandling.
Emellertid har många av de inhibitorer och D3-analoger som syntetiserats hittills visat otillräckligt kliniskt svar, såväl som oönskade biverkningar. Nu har Madhu Biyani från Kanazawa University och kollegor identifierat en DNA-härledd molekyl som binder till och hämmar funktionen av CYP24 och visar lovande antiproliferativ aktivitet. Forskargruppen ger också detaljerade insikter om de relevanta molekylära processerna som är på gång.
Forskarna screenade ett stort antal DNA-aptamerer - bitar av enkelsträngat DNA med speciella tredimensionella strukturer som kan binda till specifika målmolekyler och ha en funktionell effekt vid bindning. De letade efter DNA-aptamerer som binder till CYP24 men inte till det liknande enzymet CYP271B, som är ansvarigt för syntesen av vitamin D3.
En initial långlista med 18 aptamer-kandidater reducerades till 11 representanter med specifika molekylära strukturer. Forskarna kontrollerade CYP24-hämningsaktiviteten hos de 11 representativa aptamererna in vitro. Fyra kandidater som resulterade i hämning av CYP24 men inte i hämning av CYP27B1 återstod, varav en (Apt-7) behölls för vidare studier.
Figur 2. Internalisering av aptamer i A549-celler är oumbärlig för CYP24-hämning och förstärkning av 1,25-D3-medierad celltillväxthämning. (A) Internalisering av Aptamer i A549-celler. A549 lungcancerceller behandlades med 500 nM aptamer Apt-7 och hade sina membran färgade gröna (vetegroddsagglutinin (WGA) konjugat). Konfokalmikroskopi avslöjade den intracellulära signalen, härledd från internaliserad aptamer (röd fluorescens, Cy3). (B) Apt-7 hämmar den CYP24-medierade katabolismen av 1,25-D3 i A549-celler. Efter 18 timmars aptamerbehandling bestämdes 1, 25-D3 metabolitomvandlingsförhållande och relativ CYP24-aktivitet med HPLC. (C) Apt-7 förbättrar den antiproliferativa funktionen hos 1,25-D3 i A549-celler. Kredit:Kanazawa University
Biyani och kollegor utförde simuleringar av Apt-7-bindning till CYP24. Ett molekylärt dockningsscenario erhölls, som de kontrollerade experimentellt genom att jämföra beteendet hos en blandning av vitamin D3 och CYP24 med och utan Apt-7. Simuleringarna och experimenten visade att Apt-7 resulterar i hämning av CYP24-aktivitet, och att det som händer är att aptameren sannolikt stör enzymets aktiva ställe. Forskarna utförde också höghastighets atomkraftsmikroskopi på bindningen av CYP24 och Apt-7 i realtid, vilket bekräftar det molekylära dockningsscenariot som erhållits från simuleringar.
Slutligen studerade forskargruppen effekten av Apt-7 på cellnivå genom att introducera molekylen till cancerceller. De observerade signifikant CYP24-hämning för en cancercellinje som är känd för att överuttrycka CYP24-enzymet, vilket visar antiproliferativ aktivitet. Citerar Biyani och kollegor, dessa fynd "tydligt karakteriserade och föreslog att en DNA-aptamer-baserad molekyl skulle kunna vara en lovande ledande kandidat för anticancerterapi." + Utforska vidare
