En ny teknik som utvecklats av forskare vid ARC Center of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CNBP) kommer att hjälpa till att lysa nytt ljus på biologiska frågor genom att förbättra kvaliteten och kvantiteten av information som kan extraheras i fluorescensmikroskopi.

Tekniken, 'blekningsassisterad flerkanalsmikroskopi' (BAMM) tar en nuvarande svag fluorescensmikroskopi-fotoblekning-och förvandlar den till en styrka som förbättrar bildutmatningen med upp till tre gånger, utan ytterligare hårdvara krävs.

Rapporteras i tidningen Biomedicinsk optik Express , BAMM hjälper forskare att få biologisk inblick i de invecklade processerna som äger rum i levande celler. Detta inkluderar samspelet mellan proteiner och molekyler som har potential att påverka ett brett spektrum av hälsoområden från fertilitet, att smärta, mot hjärtsjukdomar med mera.

"Fluorescensmikroskopi är en av de mest använda teknikerna inom biologi. Det är här ljusemitterande molekyler som kallas fluoroforer är bundna till extremt små cellmål som proteiner, genetiskt material eller andra intressanta biomolekyler, "säger Dr Antony Orth, CNBP Research Fellow vid RMIT University och huvudförfattare till forskningspapperet.

"När fluoroforen exciteras av ljus från mikroskopet, den reagerar genom att avge en specifik färgsignatur. Att se den färgsignaturen under mikroskopet hjälper oss att se, spåra och förstå det cellulära målet som fluoroforen har bundits till. "

Särskilt säger Dr Orth, du kan fästa olika färgade fluoroforer till olika cellmål, allt i ett prov, för att maximera data och bildinformation som tas emot.

Denna traditionella metod för fluorescensmikroskopi är mångsidig, men det finns en stor begränsning:det synliga (eller färg) spektrumet, där de flesta fluoroforer fungerar, kan bli trångt. I ett idealiskt experiment, varje mål bör väljas för att ha ett tydligt färgemission, men detta blir allt svårare att ordna när antalet mål ökar.

"Det synliga färgspektrumet sträcker sig över ett område av 400 nanometer (nm) till 700 nm och endast cirka 200 nm av detta område är tillgängligt för fluorescensfärgemission, "förklarar Dr Orth.

"En typisk fluorofor avger över ett 50 nm intervall av färgspektrumet. Att dela 200 nm av det synliga spektrat i 50 nm segment innebär att färgerna på de fluorescerande emitterna börjar smälta ihop när du försöker pressa in mer än fyra färger."

"Detta begränsar i allmänhet forskare till fyra eller färre fluorescerande mål i ett urval, "säger Dr Orth.

"Vanligtvis, de flesta experiment är ännu mindre ambitiösa, som bara innehåller två eller tre mål. Kärnan i problemet är att endast en egenskap hos fluoroforen - dess färg - används för identifiering. "

För att övervinna denna begränsning, Dr Orth och hans medforskare har utvecklat en innovativ teknik som kallas 'blekningsassisterad flerkanalsmikroskopi' (BAMM) för att öka deras bildutmatning.

"Istället för att använda färg för att skilja mellan fluoroforer, vi använder tidens fjärde dimension och utnyttjar ett fenomen som kallas fotoblekning - dimning av en samling fluoroforer eller pigment under upprepad exponering för ljus, "säger Dr Orth.

"Eftersom varje typ av fluoroforfotblekningar i olika takt, vi kan skilja mellan fluoroforer utan att använda någon färginformation. Vi använder fotoblekningstakten som identifierare. "

"I kombination med traditionell färginformation, denna extra dimension av foto-blekning gör det möjligt för forskare att använda 2-3 gånger fler typer av fluorescerande molekyler, allt i ett prov. Detta låter oss extrahera mycket mer information från en enda undersökning. "

"Forskare kommer att kunna utforma mer informativa tester - till exempel markera fem mål när bara två tidigare var praktiska. De kommer inte längre att behöva undvika att använda två fluoroforer med samma färg, eftersom en skillnad i fotostabilitet ensam är tillräckligt för att skilja mellan de två målen, " han säger.

Traditionellt, fenomenet fotoblekning (eller blekning) har varit skadligt för den fluorescerande mikroskopiprocessen. Det är här högintensitet och pågående belysning från mikroskopet permanent förstör en fluorofores förmåga att fluorescera så att avbildning av cellmålet blir omöjligt.

"BAMM förvandlar fotoblekning från en långvarig svaghet i fluorescensmikroskopi till en betydande styrka för att möjliggöra ökad identifiering av cellulära mål, "säger Dr Orth.

"BAMM kräver ingen extra hårdvara, det är relativt enkelt att göra och kräver ingen specialprovberedning. Det är ett extremt spännande nytt tillvägagångssätt som har potential att gynna alla användare av fluorescensmikroskopi och deras undersökande vetenskap, " han säger.

Forskare som formellt deltog i BAMM -projektet var anslutna till CNBP (RMIT University och University of Adelaide) och Thermo Fisher Scientific.