En nyligen utvecklad teknik som kallas ljusarkfluorescensmikroskopi har lett till många biologiska upptäckter genom att låta forskare skapa 3D-bilder av vävnad, även levande djurembryon, använder fluorescerande taggar. Nu, forskare rapporterar möjligheten att öka bilddjupet av ljusarkfluorescensmikroskopi med hjälp av ett optiskt fenomen som kallas tre-fotonabsorption.

I tidskriften The Optical Society (OSA) Optikbokstäver , forskarna rapporterar i detalj hur tre-fotonabsorption kan användas med ljusarkfluorescensmikroskopi för att avbilda djupare in i vävnader. Som en demonstration, de använde den kombinerade tekniken för att producera tydliga bilder genom en boll av odlade celler, känd som en sfäroid, cirka 450 mikron i diameter.

"Denna demonstration är mycket viktig eftersom den tillgodoser ett otillfredsställt behov av bättre avbildning på djupet, som kan hjälpa forskare att få bättre data om biologiska processer, "sa forskargruppsledare, Kishan Dholakia från University of St. Andrews i U.K. "Detta tillvägagångssätt kan vara särskilt användbart för neurovetenskap och utvecklingsbiologiska studier och kan hitta tillämpning vid avbildning av flera prover på ett automatiserat sätt för upptäckt av läkemedel."

Ljuset som behövs för att avbilda fluorescerande etiketter kan vara skadligt och till och med dödligt för känsliga biologiska prover som hjärnvävnad eller djurembryon som används för att studera utvecklings- och sjukdomsprocesser. Ljusarkfluorescensmikroskopi möjliggör snabb, högupplöst bildbehandling med liten optisk skada eftersom det belyser ett prov med bara ett tunt ljusark; andra delar av provet får ingen onödig ljusexponering.

"Vi förväntar oss att tre-foton ljusarkfluorescensmikroskopi kommer att ha stor inverkan på avbildning av hjärnan hos gnagare som möss och råttor, där den kan användas för att fånga bilder med mycket stort fält med subcellulär upplösning, "sade tidningens första författare Adrià Escobet-Montalbán.

Djupare avbildning

Forskarna ville jämföra tre-foton ljusark-fluorescensmikroskopi med den tidigare använda två-fotonabsorptionen. Vid multiphotonabsorption, den fluorescerande etiketten avger ljus efter absorbering, eller att bli upphetsad av, två eller tre fotoner snarare än den ena fotonen som används för att producera traditionell fluorescens.

Multiphotonabsorption minskar oskärpt ljus och minimerar ljus som kan skada provet eftersom det använder längre våglängder, som sprids mindre av vävnad, och genom att begränsa excitationsljuset till en liten volym. När tre fotoner används för att producera fluorescens snarare än två, dessa fördelar förstärks.

För att demonstrera sin nya teknik, forskarna använde en standard optisk inställning för ljusarkfluorescensmikroskopi med en pulserad laser som traditionellt används för excitation av två foton. Även om denna laser inte var den mest lämpliga för att skapa effektiv excitation med tre foton, det var idealiskt för att jämföra två-foton och tre-foton excitation.

Forskargruppen avbildade sfäroider av humana embryonala njurceller med hjälp av två-foton och tre-foton-excitation. Nära sfäroidens yta, båda avbildningsmetoderna utfördes på samma sätt. Dock, längst ut på sfäroiden, bildkvaliteten för trefoton ljusarkfluorescensmikroskopi bevarade bildkontrast medan kvaliteten på tvåfotonbilden sjönk avsevärt.

Optimera tekniken

För att ytterligare förbättra djupbilden och synfältet, forskarna experimenterade med att ändra laserns ljusintensitetsprofil till en Bessel -stråle, som har en central, ljus kärna omgiven av koncentriska ringar, snarare än den traditionella solida gaussiska laserstrålen som en laserpekare.

"Besselstrålar kan användas i två-foton ljusark-läge men kan ge potentiella artefakter på grund av deras koncentriska ringar, "sa medförfattaren Federico Gasparoli." För första gången, vi visar numeriskt och experimentellt att dessa problem undertrycks i tre-foton ljusarkfluorescensmikroskopi och att strålen går ännu djupare, vilket gör detta tillvägagångssätt väldigt attraktivt. "

Nästa, forskarna planerar att förbättra tekniken genom att använda lasersystem vid längre våglängder som är speciellt utformade för absorption av tre foton. Detta bör möjliggöra avbildning på ökat djup. Parallellt, forskarna arbetar med att utveckla sätt att upptäcka ljuset från fluorescerande etiketter djupt inuti prover.