Forskare har utvecklat en enkel metod för att samtidigt förvärva bilder på olika djup med ett standardmikroskop. Den nya tekniken kan tillämpas på en mängd olika mikroskopimetoder, vilket gör den användbar för ett brett spektrum av biologiska och biomedicinska avbildningstillämpningar.

"Optisk mikroskopi har varit ett oumbärligt verktyg för att studera 3D-komplexa biologiska system och processer, "sade Sheng Xiao, medlem i forskargruppen från Boston University. "Vår nya multifokusteknik gör att levande celler och organismer kan observeras vid höga hastigheter och med hög kontrast."

I Optica , The Optical Society's (OSA) tidskrift för högeffektiv forskning, forskare under ledning av Jerome Mertz beskriver sitt nya enkla och snabba sätt att skaffa information från olika djup med standardmikroskopi. Det nya tillvägagångssättet kan enkelt läggas till i de flesta befintliga system och är lätt att replikera, gör det tillgängligt för andra forskare.

Ta flerfokusbilder

Standardkamerabaserade mikroskopisystem förvärvar skarpa bilder vid ett enda fokusplan. Även om forskare har försökt olika strategier för att samtidigt förvärva bilder med olika brännvidd, dessa metoder kräver vanligtvis flera kameror eller använder ett specialiserat diffraktivt optiskt element för att utföra bilddelning med en enda kamera. Båda strategierna är komplexa, och ett diffraktivt optiskt element kan vara svårt att tillverka.

"Vi använde ett z-splitter-prisma som kan monteras helt från komponenter från hyllan och som enkelt kan appliceras på en mängd olika avbildningsmetoder som fluorescens, fas-kontrast eller mörkfältavbildning, "sa Xiao.

Z-delarens prisma delar detekterat ljus för att samtidigt producera flera bilder i en enda kameraram. Varje bild är fokuserad på ett annat djup i provet. Genom att använda en höghastighetskamera med ett stort sensorområde och hög pixeltal kunde forskarna distribuera flera högupplösta bilder på samma sensor utan någon överlappning.

De multifokala bilderna som förvärvats med den nya tekniken gör det möjligt att uppskatta den outfokuserade bakgrunden från provet mycket mer exakt än vad som kan göras med en enda bild. Forskarna använde denna information för att utveckla en förbättrad 3-D-suddningsalgoritm som eliminerar det bakgrundsbelysning som inte är i fokus som ofta är ett problem när man använder bredfältsmikroskopi.

"Vår utökade volym 3-D-suddningsalgoritm undertrycker långt borta från fokus från källor bortom bildvolymen, "sa Xiao." Detta förbättrar både bildkontrast och signal-brusförhållande, vilket gör det särskilt fördelaktigt i fluorescensavbildningsapplikationer som involverar tjocka prover. "

Demonstrerad mångsidighet

Forskarna demonstrerade den nya tekniken med vanliga mikroskopimetoder, inklusive fluorescens, faskontrast och mörkfältavbildning. De tog stora 3D-bilder med synfält som omfattade hundratals neuroner eller hela fritt rörliga organismer samt höghastighets 3D-bilder av en rotifer cilia, som slår varje hundradels sekund. Detta visade hur tillvägagångssättet ger flexibilitet att prioritera ett stort synfält eller hög hastighet.

För att demonstrera möjligheterna med den utökade algoritmen för 3D-deblurering, forskarna avbildade olika tjocka prover, inklusive hjärnan hos en levande mus. De observerade signifikanta kontrast- och signal-brusförhållandeförbättringar jämfört med både obehandlade multifokusbilder och mer traditionella 3-D-suddningsalgoritmer. Forskarna arbetar nu med att utöka tekniken så att den kommer att fungera med ännu fler avbildningsmetoder.