Forskare vid University of Tokyo har hittat ett sätt att öka känsligheten hos befintlig kvantitativ fasavbildning så att alla strukturer inuti levande celler kan ses samtidigt, från små partiklar till stora strukturer. Denna konstnärliga representation av tekniken visar pulser av skulpterat ljus (grönt, topp) färdas genom en cell (mitten), och gå ut (botten) där förändringar i ljusvågorna kan analyseras och omvandlas till en mer detaljerad bild. Upphovsman:s-graphics.co.jp, CC BY-NC-ND
Experter inom optisk fysik har utvecklat ett nytt sätt att se inuti levande celler i större detalj med hjälp av befintlig mikroskopiteknik och utan att behöva lägga till fläckar eller fluorescerande färgämnen.
Eftersom enskilda celler är nästan genomskinliga, Mikroskopkameror måste upptäcka extremt subtila skillnader i ljuset som passerar genom cellens delar. Dessa skillnader är kända som ljusets fas. Kamerans bildsensorer begränsas av hur mycket ljusfasskillnad de kan upptäcka, kallas dynamiskt omfång.
"För att se större detaljer med samma bildsensor, vi måste utöka det dynamiska området så att vi kan upptäcka mindre fasförändringar av ljus, " sa docent Takuro Ideguchi från University of Tokyo Institute for Photon Science and Technology.
Forskargruppen utvecklade en teknik för att ta två exponeringar för att mäta stora och små förändringar i ljusfas separat och sedan sömlöst ansluta dem för att skapa en mycket detaljerad slutbild. De namngav sin metod adaptivt dynamiskt intervallskift kvantitativ fasavbildning (ADRIFT-QPI) och publicerade nyligen sina resultat i Ljus:Vetenskap och tillämpningar .
"Vår ADRIFT-QPI-metod behöver ingen speciell laser, inga speciella mikroskop eller bildsensorer; vi kan använda levande celler, vi behöver inga fläckar eller fluorescens, och det finns mycket liten chans för fototoxicitet, sa Ideguchi.
Fototoxicitet avser att döda celler med ljus, som kan bli ett problem med vissa andra bildtekniker, såsom fluorescensavbildning.
Bilder av kiselpärlor tagna med konventionell kvantitativ fasavbildning (överst) och en tydligare bild producerad med en ny ADRIFT-QPI mikroskopimetod (nederst) utvecklad av ett forskarlag vid University of Tokyo. Bilderna till vänster är bilder av den optiska fasen och bilderna till höger visar den optiska fasförändringen på grund av den mellaninfraröda (molekylärspecifika) ljusabsorptionen av kiseldioxidpärlorna. I denna proof-of-concept demonstration, forskare beräknade att de uppnådde ungefär 7 gånger högre känslighet med ADRIFT-QPI än med konventionell QPI. Kredit:Toda et al., CC-BY 4.0
Kvantitativ fasavbildning skickar en puls av ett platt ljusark mot cellen, mäter sedan fasförskjutningen av ljusvågorna efter att de passerat genom cellen. Datoranalys rekonstruerar sedan en bild av de stora strukturerna inuti cellen. Ideguchi och hans medarbetare har tidigare banat väg för andra metoder för att förbättra kvantitativ fasmikroskopi.
Kvantitativ fasavbildning är ett kraftfullt verktyg för att undersöka enskilda celler eftersom det tillåter forskare att göra detaljerade mätningar, som att spåra tillväxthastigheten för en cell baserat på förändringen i ljusvågor. Dock, den kvantitativa aspekten av tekniken har låg känslighet på grund av bildsensorns låga mättnadskapacitet, så att spåra nanostora partiklar i och runt celler är inte möjligt med ett konventionellt tillvägagångssätt.
Den nya ADRIFT-QPI-metoden har övervunnit begränsningen av dynamiskt omfång för kvantitativ fasavbildning. Under ADRIFT-QPI, kameran tar två exponeringar och producerar en slutlig bild som har sju gånger större känslighet än traditionella kvantitativa fasmikroskopbilder.
Den första exponeringen produceras med konventionell kvantitativ fasavbildning - ett plant ljusark pulseras mot provet och ljusets fasförskjutningar mäts efter att det passerat genom provet. Ett datorbildanalysprogram utvecklar en bild av provet baserat på den första exponeringen och designar sedan snabbt en skulpterad vågfront av ljus som speglar den bilden av provet. En separat komponent som kallas en vågfrontsformningsanordning genererar sedan denna "ljusskulptur" med ljus med högre intensitet för starkare belysning och pulserar den mot provet för en andra exponering.
Om den första exponeringen gav en bild som var en perfekt representation av provet, de specialskulpterade ljusvågorna från den andra exponeringen skulle komma in i provet i olika faser, passera genom provet, sedan framträda som ett platt ark av ljus, vilket gör att kameran inte ser något annat än en mörk bild.
"Detta är det intressanta:Vi raderar typ av provets bild. Vi vill se nästan ingenting. Vi tar bort de stora strukturerna så att vi kan se de mindre i detalj, " förklarade Ideguchi.
En standardbild (överst) tagen med konventionell kvantitativ fasavbildning och en tydligare bild (botten) producerad med en ny ADRIFT-QPI mikroskopimetod utvecklad av ett forskarlag vid University of Tokyo. Fotona till vänster är bilder av den optiska fasen och bilder till höger visar den optiska fasförändringen på grund av den mitten av infraröda (molekylspecifika) ljusabsorptionen främst av protein. Blå pil pekar mot kärnans kant, vit pil pekar mot nukleolerna (en understruktur inuti kärnan), och gröna pilar pekar mot andra stora partiklar. Kredit:Toda et al., CC-BY 4.0
I verkligheten, den första exponeringen är ofullkomlig, så de skulpterade ljusvågorna framträder med subtila fasavvikelser.
Den andra exponeringen avslöjar små ljusfasskillnader som "tvättades ut" av större skillnader i den första exponeringen. Dessa återstående små ljusfasskillnader kan mätas med ökad känslighet på grund av den starkare belysningen som används i den andra exponeringen.
Ytterligare datoranalys rekonstruerar en slutlig bild av provet med ett utökat dynamiskt område från de två mätresultaten. I proof-of-concept-demonstrationer, forskare uppskattar att ADRIFT-QPI producerar bilder med sju gånger högre känslighet än konventionell kvantitativ fasavbildning.
Ideguchi säger att den verkliga fördelen med ADRIFT-QPI är dess förmåga att se små partiklar i sammanhanget av hela den levande cellen utan att behöva några etiketter eller fläckar.
"Till exempel, små signaler från partiklar i nanoskala som virus eller partiklar som rör sig inuti och utanför en cell kan detekteras, vilket möjliggör samtidig observation av deras beteende och cellens tillstånd, sa Ideguchi.
