a, Energidiagram av STED-SREF. b, Spektroskopikonfiguration av STED-SREF. Nitrilläget för Rhodamine 800 (Rh800) används här. c, SREF/STED-SREF-avbildning av Rh800-färgade E. coli-celler med pumpvåglängder inställda på 836 nm (avresonans för nitrilläge) och 838 nm (vibrationsresonans för nitrilläge). Direkt koppling av stimulerad emission depletion (STED) med SREF-avbildning misslyckas med att uppnå önskade upplösningsförbättringar. Anti-Stokes-fluorescensbakgrunden (visas i SREF-pump=836 nm) har en oönskad roll för att förhindra direkt användning av superupplösningsfluorescensteknik. Kredit:Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Sann superupplösningsavbildning bortom diffraktionsgränsen är fortfarande en stor utmaning för Raman-mikroskopi på långt håll, särskilt i biologiska tillämpningar. Utnyttja Stimulerad Raman Excited Fluorescence (SREF) som en ultrakänslig vibrationskontrast, ett team vid Columbia University har nyligen uppfunnit en ny vibrationsmikroskopi med superupplösning. Deras nya metod öppnar upp för superupplösning, nanometer-spektral-upplösning flerfärgad vibrationsavbildning av biologiska system.
Det har varit en lång strävan att utveckla superupplösningstekniker för Raman-mikroskopi, som har inneboende fördelar med kemisk specificitet jämfört med dess fluorescensmotsvarighet. Trots den upplevda betydelsen och omfattande forskningsinsatser, sann superupplösning (definierad som diffraktion-obegränsad) Raman-avbildning av biologiska system i det optiska fjärrfältet är fortfarande utmanande på grund av bristen på känslighet för konventionell Raman-spridning. Följaktligen, de rapporterade superupplösta vibrationsmetoderna är baserade på excitationsmättning, utarma, eller hög ordningens olinjäritet för Raman-övergångarna. Dessa kräver extremt intensiv laserkraft för att uppnå en måttlig upplösningsförbättring (ofta mindre än en faktor 2), som hämmar dess användbarhet för biologisk tillämpning.
I en ny tidning publicerad i Ljus:Vetenskap och tillämpningar , ett team av forskare, ledd av professor Wei Min från Columbia University, USA, har utvecklat en ny superupplösning vibrationsmikroskopi som utnyttjar Stimulated Raman Excited Fluorescence (SREF) som en ultrakänslig vibrationskontrast. SREF kopplar vibrationsexcitationen med fluorescensdetektion och möjliggör Raman-spektroskopi över hela fältet med känslighet ner till en enda molekyl. Dock, direkt koppling av stimulerad emissionsutarmning (STED) med SREF-avbildning lyckas inte uppnå superupplösningsavbildning på grund av närvaron av anti-stokes-fluorescensbakgrunden, som inte kan tömmas av STED-strålen.
a, det råa SREF-spektrumet för Rh800-nitrilmoden erhållits genom konventionell SREF-excitering (röd kurva) och motsvarande bakgrundsfria FM-SREF-spektrum som erhållits genom FM-SREF-excitering. b, FM-SREF-avbildning och elektronisk pre-resonansstimulerad Raman-spridning (epr-SRS) avbildning av Rh800-färgade E. coli-celler. c, motsvarande intensitetsfördelning för FM-SREF och epr-SRS längs motsvarande vita streckade linjer i (b). d, kemiska strukturer hos de två använda SREF-färgämnena. e, absorptionsspektra (heldragna kurvor) och emissionsspektra (streckkurvor) för de två färgämnena i vatten, som inte är upplösbara för konventionell fluorescensspektroskopi. f, FM-SREF-spektra för nitrilmoden för de två färgämnena. g, flerfärgs FM-SREF-avbildning av S. cerevisiae-celler. Kredit:Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
I detta nya verk, teamet tog fram en frekvensmoduleringsstrategi (FM) för att ta bort denna bredbandsbakgrund. Genom att temporärt modulera excitationsfrekvensen på och av den riktade vibrationsresonansen men fortfarande inom bakgrundens breda linjebredd, de kan generera en intensitetsmodulering på den rena vibrationssignalen (men inte på bakgrunden). Den bakgrundsfria vibrationssignalen kan därefter demoduleras genom en inlåsningsdetektering. Jämfört med det typiska råa SREF-spektrumet, spektrumet som förvärvats av FM-SREF representerar den rena SREF-signalen, som möjliggör bakgrundsfri SREF-avbildning med hög kontrast. De syntetiserade ytterligare nya isotopredigerade SREF-färgämnen för att underlätta flerfärgs FM-SREF biologisk avbildning med skarp vibrationskontrast. Två vibrationsfärger separeras av FM-SREF med minimal överhörning, vilket är nästan omöjligt med konventionell fluorescensmikroskopi. Sådan kemisk specificitet för vibrationsavbildning har unika fördelar för multiplexerad optisk avbildning.
a, systemdiagrammet för STED-FM-SREF-mikroskopi. b, avbildning av samma Rh800-färgade E. coli-celler med FM-SREF-mikroskopi och STED-FM-SREF-mikroskopi och motsvarande intensitetsfördelningar längs de streckade linjerna. c, avbildning av samma förening-A-färgade Cos7-cellkärna med FM-SREF-mikroskopi och STED-FM-SREF-mikroskopi och motsvarande intensitetsfördelningar längs de streckade linjerna. Kredit:Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Till sist, genom att integrera STED med bakgrundsfri FM-SREF, de åstadkom vibrationsbilder med hög kontrast och superupplösning med STED-FM-SREF, vars rumsliga upplösning endast bestäms av signal-till-bruset. De visade mer än två gånger upplösningsförbättring i biologiska system med måttlig laserexcitationskraft. Med framtida optimering av instrumenterings- och bildsonderna, STED-FM-SREF mikroskopi är tänkt att hjälpa en mängd olika biologiska tillämpningar, med sin fantastiska upplösning, hög känslighet, unik vibrationskontrast, och biokompatibel excitationskraft.
