Multiplexeringsförmågan hos fluorescensmikroskopi är starkt begränsad av den breda fluorescensspektrala bredden. Spectral imaging erbjuder potentiella lösningar, men typiska tillvägagångssätt för att sprida de lokala emissionsspektra hindrar särskilt den uppnåbara genomströmningen och sätter betydande begränsningar för tidsupplösning. Avstämbara bandpassfilter ger en möjlighet att skanna igenom emissionsvåglängden i det breda fältet. Dock, applicering av smala bandpass på fluorescensemissionen resulterar i ineffektiv användning av den knappa signalen.

I en ny tidning publicerad i Ljus:Vetenskap och tillämpningar , ett team av forskare, ledd av professor Ke Xu från College of Chemistry, University of California, Berkeley, USA har visat att man använder en enda, fast fluorescensemissionsdetektionsband, genom ramsynkroniserad snabb skanning av excitationsvåglängden från en vit lampa via ett akustooptiskt avstämbart filter (AOTF), upp till 6 subcellulära mål, märkt av vanliga fluoroforer med betydande spektral överlappning, kan avbildas samtidigt i levande celler med låg (~1%) överhörning och hög tidsupplösning (ned till ~10 ms).

Den påvisade förmågan att kvantifiera förekomsten av olika fluoroforer i samma prov genom att blanda upp excitationsspektra gjorde det möjligt för dem att ta fram nya, kvantitativa avbildningsscheman för både bi-state och FRET (Förster resonance energy transfer) fluorescerande biosensorer i levande celler. De uppnådde således full-frame hög känslighet och spatiotemporala upplösningar vid kvantifiering av mitokondriella matris pH och den intracellulära makromolekylära trängseln. De avslöjade således betydande rumsliga heterogeniteter i båda parametrarna, inklusive spontana plötsliga hopp i den mitokondriella matrisens pH-värde åtföljd av dramatiska mitokondriella formförändringar. De visade vidare, för första gången, multiplexering av absolut pH-avbildning med ytterligare tre målorganeller/proteiner för att belysa komplexet, Parkinmedierad mitofagiväg.

"Den potentiella utvidgningen av vårt tillvägagångssätt till ännu fler fluoroforer kan uppnås genom att ytterligare öka antalet excitationsvåglängder eller integrera emissionsdispersion. Medan vi i detta arbete fokuserade på ett lättillgängligt system baserat på ett lampstyrt epifluorescensmikroskop, den snabba multifluoroforen och kvantitativa biosensoravbildningsförmågan vi visade här borde lätt kunna utökas till andra system, inklusive ljusarksfluorescensmikroskopi och strukturerad belysningsmikroskopi", kommenterade forskarna.

Tillsammans, dessa resultat "avslöjar de exceptionella möjligheter som excitationsspektralmikroskopi ger för mycket multiplexerad fluorescensavbildning. Utsikten att få snabba spektralbilder i det breda fältet utan behov av fluorescensspridning eller omsorg om detektorns spektrala respons erbjuder en enorm potential, ", avslutar forskarna.