För att skapa högupplösta 3D-bilder av vävnader som hjärnan, forskare använder ofta tvåfotonmikroskopi, vilket innebär att man riktar en högintensiv laser mot provet för att inducera fluorescensexcitation. Dock, att skanna djupt i hjärnan kan vara svårt eftersom ljus sprids från vävnader när det går djupare, gör bilder suddiga.

Tvåfotonavbildning är också tidskrävande, eftersom det vanligtvis kräver att man skannar enskilda pixlar en i taget. Ett team av forskare från MIT och Harvard University har nu utvecklat en modifierad version av tvåfotonavbildning som kan avbilda djupare i vävnaden och utföra avbildningen mycket snabbare än vad som tidigare var möjligt.

Denna typ av avbildning skulle kunna göra det möjligt för forskare att snabbare få högupplösta bilder av strukturer som blodkärl och enskilda neuroner i hjärnan, säger forskarna.

"Genom att modifiera laserstrålen som kommer in i vävnaden, vi visade att vi kan gå djupare och vi kan göra finare avbildning än de tidigare teknikerna, säger Murat Yildirim, en MIT-forskare och en av författarna till den nya studien.

MIT doktorand Cheng Zheng och tidigare postdoc Jong Kang Park är huvudförfattarna till tidningen, som visas idag i Vetenskapens framsteg . Dushan N. Wadduwage, en före detta MIT postdoc som nu är John Harvard Distinguished Science Fellow in Imaging vid Center for Advanced Imaging vid Harvard University, är tidningens seniorförfattare. Andra författare inkluderar Josiah Boivin, en MIT postdoc; Yi Xue, en före detta MIT-student; Mriganka Sur, Newtonprofessorn i neurovetenskap vid MIT; och Peter Så, en MIT-professor i maskinteknik och i biologisk teknik.

Djup avbildning

Tvåfotonmikroskopi fungerar genom att lysa en intensiv stråle av nära-infrarött ljus på en enda punkt i ett prov, inducerar samtidig absorption av två fotoner vid brännpunkten, där intensiteten är som högst. Denna långa våglängd, lågenergiljus kan tränga djupare in i vävnaden utan att skada den, möjliggör avbildning under ytan.

Dock, två-foton excitation genererar bilder genom fluorescens, och den fluorescerande signalen är i det synliga spektralområdet. Vid avbildning djupare in i vävnadsprover, det fluorescerande ljuset sprids mer och bilden blir suddig. Att avbilda många lager av vävnad är också mycket tidskrävande. Genom att använda bredfältsbilder, där ett helt vävnadsplan belyses på en gång, kan påskynda processen, men upplösningen för detta tillvägagångssätt är inte lika stor som för punkt-för-punkt-skanning.

MIT-teamet ville utveckla en metod som skulle tillåta dem att avbilda ett stort vävnadsprov på en gång, samtidigt som den höga upplösningen för punkt-för-punkt-skanning bibehålls. För att uppnå det, de kom på ett sätt att manipulera ljuset som de lyser på provet. De använder en form av bredfältsmikroskopi, skiner ett plan av ljus på vävnaden, men ändra ljusets amplitud så att de kan slå på eller stänga av varje pixel vid olika tidpunkter. Vissa pixlar lyser upp medan närliggande pixlar förblir mörka, och detta fördesignade mönster kan detekteras i ljuset som sprids av vävnaden.

"Vi kan slå på eller av varje pixel genom den här typen av modulering, " säger Zheng. "Om vi ​​stänger av några av fläckarna, som skapar utrymme runt varje pixel, så nu kan vi veta vad som händer på var och en av de enskilda platserna."

Efter att forskarna fått de råa bilderna, de rekonstruerar varje pixel med hjälp av en datoralgoritm som de skapade.

"Vi kontrollerar ljusets form och vi får responsen från vävnaden. Från dessa svar, vi försöker lösa vilken typ av spridning vävnaden har. När vi gör rekonstruktionerna från våra råa bilder, vi kan få mycket information som du inte kan se i råbilderna, " säger Yildirim.

Genom att använda denna teknik, forskarna visade att de kunde avbilda cirka 200 mikrometer djupt in i skivor av muskel- och njurvävnad, och cirka 300 mikron in i hjärnan på möss. Det är ungefär dubbelt så djupt som möjligt utan denna mönstrade excitation och beräkningsrekonstruktion, säger Yildirim. Tekniken kan också generera bilder på cirka 100 till 1, 000 gånger snabbare än konventionell tvåfotonmikroskopi.

Hjärnans struktur

Denna typ av avbildning borde göra det möjligt för forskare att snabbare få högupplösta bilder av nervceller i hjärnan, såväl som andra strukturer såsom blodkärl. Att avbilda blodkärl i hjärnan hos möss kan vara särskilt användbart för att lära dig mer om hur blodflödet påverkas av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, säger Yildirim.

"Alla studier av blodflödet eller morfologin hos blodkärlsstrukturerna är baserade på två-foton- eller tre-foton-punktskanningssystem, så de är långsamma, " säger han. "Genom att använda den här tekniken, vi kan verkligen utföra höghastighetsvolymetrisk avbildning av blodflödet och blodkärlsstrukturen för att förstå förändringarna i blodflödet."

Tekniken kan också lämpa sig för att mäta neuronaktivitet, genom att lägga till spänningskänsliga fluorescerande färgämnen eller fluorescerande kalciumsonder som lyser upp när nervceller exciteras. Det kan också vara användbart för att analysera andra typer av vävnad, inklusive tumörer, där den kan användas för att hjälpa till att bestämma kanterna på en tumör.