Högprövande vätskekromatografi är en teknik för laboratorieanalys av en blandning. Det är en effektiv typ av kromatografi som använder högt tryck, snarare än enbart gravitation, för att driva ett prov av en blandning genom en kolonn. Ett prov injiceras, då hjälper en pump som innehåller höga tryckmängder att flytta provet längs en packad kolonn, där den separeras i enskilda komponenter. Denna separation analyseras sedan av en detektor för att ge resultat.

Injektionsplats

För att injiceras i en HPLC måste ett prov först lösas i ett polärt vätskeformigt lösningsmedel, helst ett med kända HPLC-spektra så att dess data kan särskiljas från provets. Vätskelösningen som innehåller provet placeras i instrumentet och skickas in i kolonnen. Den aktuella platsen för injektionsstället beror på instrumentets märke. I de flesta fall automatiseras injektionsprocessen, men i vissa fall måste en laboratoriearbetare injicera provet med en liten sprutnål.

Pumpkomponent

Pumpkomponenten i HPLC-enheten är nödvändig eftersom det ger det tryck som driver provet genom kolonnen. Pumpstyrkan varierar, men en kraftfull kan ge ett tryck på upp till 6000 psi eller pund per kvadrattum, som appliceras efter provet injiceras. Detta gör det möjligt för provet att passera genom kolonnen snabbare och effektivt än om det skulle droppa genom att endast använda tyngdkraften.

Kolumnbeskrivning

En ökad hastighet på ett prov passerat genom kolonn med en pump möjliggör användning av en annan typ av kolonn än de som användes vid enkel vätskekromatografi. Förpackningsmaterialet i kolonnen kan ha en mycket mindre partikelstorlek, vilket ökar ytan och hjälper därför samverkan av provet med kolonnen. De flesta HPLC-kolumner arbetar genom polaritet. Provet löses i ett polärt lösningsmedel, och kolonnen består av i stort sett icke-polära kolväten. De polära delarna av provmolekylen passerar genom kolonnen mycket snabbt, eftersom de i huvudsak interagerar med lösningsmedlet, medan provets icke-polära komponenter ligger kvar i kolonnen och bildar svaga interaktioner med kolonnkomponenterna. Därför kommer provets komponenter från kolonnen i stället från de flesta polära till de flesta icke polära.

Detektorfunktionen

Detektorerna varierar också beroende på vilken typ av HPLC-instrument som används. Dock fungerar de flesta på samma grundläggande sätt. En källa till ultraviolett ljus lyser på de separerade provkomponenterna när de kommer från kolonnen. De flesta organiska föreningar absorberar en viss mängd ljus, så när de passerar av den applicerade ljusstrålen, kan en detektor hämta upp hur mycket ljus som absorberas. Detektorn registrerar också komponenternas retentionstid baserat på den ordning i vilken de kommer från kolonnen. Denna utgång kan sedan analyseras baserat på toppområde för att bestämma exakt naturen hos provets komponenter.