Forskare har utvecklat en etikettfri och icke-invasiv Raman-spektroskopi som kan ta mikroskopiska bilder av biologiska prover och identifiera ett brett utbud av biomolekyler med oöverträffad hastighet och känslighet.

"Vårt arbete kan leda till en icke-invasiv, etikettfri och användarvänlig enhet för klinisk användning", säger forskargruppsledaren Dario Polli från Politecnico di Milano i Italien. "Detta innovativa mikroskop, tillsammans med djupinlärningsbaserade algoritmer, kan så småningom göra det enklare och snabbare att diagnostisera cancer genom att tillåta visualisering av de kemiska beståndsdelarna i mänskliga vävnader och celler."

I tidskriften Optics Express , beskriver forskarna sin nya teknik, som är baserad på koherent anti-stokes Raman scattering (CARS) mikroskopi. CARS-mikroskopi producerar bilder baserade på molekylers vibrationssignaturer genom att utnyttja interaktionen mellan ultrakorta laserpulser och biologiska prover.

Det nya tillvägagångssättet ger tillgång till det svårupptäckta området av vibrationsspektrumet känt som fingeravtrycksområdet, som sträcker sig från 400 till 1800 cm ⁻¹ . Även om många enskilda föreningar kan identifieras med hjälp av deras vibrationsfingeravtryck i denna region, tenderar det att producera svaga signaler som är svåra att upptäcka.

"Vanligt använda tekniker inom biomedicinsk vetenskap kräver ofta färgning, vilket inte bara är besvärligt utan kan också introducera strukturella och kemiska förändringar som kan leda till artefakter, eller fel, i bildbehandling och databehandling", säger Polli. "Eftersom vårt system kan skilja mellan många olika kemiska arter i biologiska vävnader utan märkning, kan det vara användbart för levande cellavbildning och analysera vävnadsbiopsier."

Lägre upprepningsfrekvens, snabbare bildbehandling

Detta nya arbete är en del av CRIMSON-projektet, som syftar till att utveckla en nyckelfärdig avbildningsenhet som använder vibrationsspektroskopi för snabb cell- och vävnadsklassificering. Projektets mål är att omvandla studiet av sjukdomars cellulära ursprung för att möjliggöra nya tillvägagångssätt som kan främja personlig terapi.

Som ett viktigt steg mot detta mål utvecklade forskarna ett CARS-mikroskop baserat på en kommersiell laser som producerar ultrakorta pulser med varaktigheter på cirka 270 femtosekunder i det nära-infraröda våglängdsområdet. De designade mikroskopisystemet för att använda laserpulser med en repetitionsfrekvens på 2 MHz, vilket är mycket lägre än de 40 eller 80 MHz som används av de flesta andra CARS-system.

Denna lägre upprepningshastighet minskar fototermisk skada på provet eftersom det skapar en fördröjning på 0,5 mikrosekunder mellan två på varandra följande pulser. Den producerar också en högre pulsenergi och toppintensitet vid brännpunkten, vilket genererar en starkare CARS-signal och tillåter en snabbare insamlingshastighet.

"Den viktigaste fördelen med den lägre upprepningsfrekvensen är att den tillät oss att generera bredband, rödskiftade Stokes-pulser som täcker hela fingeravtryckets vibrationsregion genom att använda superkontinuumgenerering i vitt ljus i en bulkkristall", säger Federico Vernuccio, doktorand. vid Politecnico di Milano och första författare till studien. "Jämfört med andra metoder är detta tillvägagångssätt tekniskt sett enklare, mer kompakt och robust."

Att använda ett spektralområde som är rödförskjutet jämfört med standardinställningar innebär att högre laserintensiteter kan användas innan fotoskadan börjar. Forskarna utvecklade också nya algoritmer som kombinerar vanliga numeriska beräkningsmetoder med artificiell intelligens. Dessa algoritmer hämtar mer information från den inhämtade datan och omvandlar den till bilder som gör att olika kemiska arter lätt kan särskiljas.

"Tack vare våra förbättringar levererar CARS-systemet högkvalitativa bilder med en toppmodern insamlingshastighet", säger Vernuccio. "Vårt system har en uppehållstid på mindre än 1 millisekund utan att kompromissa med provets integritet. Denna hastighet begränsas av spektrometerns uppdateringsfrekvens."

Hög hastighetskänslighet

För att testa sitt system använde forskarna referensprover för att jämföra spektra hämtade med det nya mikroskopet med de som förvärvats med hjälp av en toppmodern, men långsammare, vibrationsspektroskopiteknik. De två metoderna visade utmärkt överensstämmelse, vilket visade att det nya systemet kunde leverera spektra vid mycket höga hastigheter med bra spektral upplösning och kemisk specificitet.

Forskarna bestämde sedan detektionsgränsen för deras system genom att skaffa CARS-spektra av en uppsättning dimetylsulfoxidlösningar med olika koncentrationer. Systemet kunde mäta kemisk koncentration med den oöverträffade känsligheten på 14,1 mmol/liter, ungefär dubbelt så hög känslighet som andra CARS-system som arbetar i fingeravtrycksregionen.

De visade också systemets förmåga att särskilja och lokalisera olika genomskinliga mikronstora plastpärlor baserat på deras vibrationssignatur och tog mätningar från biologiska vävnader för att visa att tekniken fungerar på biologiska prover utan att orsaka skada.

"Vårt CARS-mikroskop tillåter etikettfri avbildning med kemisk specificitet vid högre hastigheter, vilket gör Raman-avbildning av levande celler mer genomförbar", säger Polli. "Detta kan göra att vårt system kan användas för att analysera interaktioner mellan cancerceller och immunceller eller för att karakterisera hur kemoterapi påverkar celler, till exempel."

Forskarna arbetar nu med att förbättra sitt system genom att skapa ett ännu bredare våglängdsområde av Stokes-pulser genom generering av superkontinuum i vitt ljus. Detta skulle förbättra både avbildningshastigheten och antalet detekterbara kemiska analyter. De arbetar också mot kommersialisering genom att utveckla användarvänlig programvara, kompakta optiska källor och design för en kommersiell prototyp och detektionssystem. + Utforska vidare

THz–fingeravtrycksvibrationsspektroskopi vid en ultrasnabb spektralhastighet