Schematisk sekvensering av DNA-sekvensering av en enskild molekyl av en nanopor med fosfatmärkta nukleotider. Var och en av de fyra nukleotiderna kommer att bära en annan tagg. Under SBS, dessa taggar, fäst via nukleotidens terminalfosfat, kommer att släppas in i nanoporen en i taget där de kommer att producera unika nuvarande blockadsignaturer för sekvensbestämning. En stor mängd sådana nanoporer kommer att leda till DNA-sekvensering med hög genomströmning.
(Phys.org) —DNA -sekvensering är drivkraften bakom viktiga upptäckter inom medicin och biologi. Till exempel, den fullständiga sekvensen av en individs genom ger viktiga markörer och riktlinjer för medicinsk diagnostik och hälsovård. Tills nu, den största vägspärren har varit kostnaden och hastigheten för att erhålla mycket exakta DNA-sekvenser. Även om många framsteg har gjorts under de senaste 10 åren, de flesta nuvarande instrument för sekvensering av hög genomströmning är beroende av optiska tekniker för detektering av de fyra byggstenarna i DNA:A, C, G och T. För att ytterligare förbättra mätförmågan, elektronisk DNA-sekvensering av en ensemble av DNA-mallar har också utvecklats.
Nyligen, det har visat sig att DNA kan träs genom porer i proteinnanoskala under en pålagd elektrisk ström för att producera elektroniska signaler på en molekylnivå. Dock, eftersom de fyra nukleotiderna är mycket lika i sina kemiska strukturer, de kan inte lätt urskiljas med denna teknik. Således, forskning och utveckling av en elektronisk DNA-sekvenseringsplattform med en enda molekyl är det mest aktiva undersökningsområdet och har potential att producera en handhållen DNA-sekvenserare som kan dechiffrera genomet för personlig medicin och grundläggande biomedicinsk forskning.
Ett team av forskare vid Columbia University, leds av Dr Jingyue Ju (Samuel Ruben-Peter G. Viele professor i teknik, Professor i kemiteknik och farmakologi, Direktör för Center for Genome Technology and Biomolecular Engineering), med kollegor vid National Institute of Standards and Technology (NIST) under ledning av Dr. John Kasianowicz (stipendiat i American Physical Society), har utvecklat ett nytt tillvägagångssätt för att potentiellt sekvensera DNA i nanoporer elektroniskt på en molekylnivå med enkelbasupplösning. Detta jobb, med titeln "PEG-märkta nukleotider och Nanopore-detektion för enkelmolekyl-DNA-sekvensering genom syntes" är nu tillgänglig i online-tidskriften open access, Vetenskapliga rapporter , från Naturpublikationsgruppen.
Den rapporterade nanoporbaserade sekvensering genom syntes (Nano-SBS)-strategin kan exakt särskilja fyra DNA-baser genom att detektera 4 taggar av olika storlek frisatta från 5'-fosfatmodifierade nukleotider på enstaka molekylnivå för sekvensbestämning. Grundprincipen för Nano-SBS-strategin beskrivs enligt följande. Eftersom varje nukleotidanalog inkorporeras i den växande DNA-strängen under polymerasreaktionen, dess tag frisätts genom fosfodiesterbindningsbildning. Etiketterna kommer in i en nanopor i den ordning de släpps, producerar unika jonströmsblockadsignaturer på grund av deras distinkta kemiska strukturer, därigenom bestämmer DNA-sekvensen elektroniskt på enstaka molekylnivå med enkelbasupplösning. Som princip-bevis, forskargruppen fäste fyra olika långa polymertaggar till det terminala fosfatet av 2'-deoxyguanosin-5'-tetrafosfat (en modifierad DNA-byggsten) och visade effektiv inkorporering av nukleotidanalogerna under polymerasreaktionen, såväl som bättre än baslinjediskriminering bland de fyra taggarna på enstaka molekylnivå baserat på deras nanopore jonströmsblockadsignaturer. Detta tillvägagångssätt i kombination med polymeras fäst vid nanoporerna i ett arrayformat bör ge en elektronisk Nano-SBS-plattform med en molekyl.
I tidigare arbeten, Center of Genome Technology &Biomolecular Engineering vid Columbia University, ledd av professor Ju och doktor Nicholas J. Turro (William P. Schweitzer professor i kemi), utvecklat en fyrfärgad DNA-sekvensering genom syntes (SBS)-plattform med användning av klyvbara fluorescerande nukleotidreversibla terminatorer (NRT), som är licensierad till Intelligent Bio-Systems, Inc., ett QIAGEN -företag. SBS med klyvbara fluorescerande NRT är den dominerande metoden som används i nästa generations DNA-sekvenseringssystem. Dr. Kasianowicz och hans grupp vid NIST var pionjärer i undersökningen av nanoporer för analys av en enda molekyl. De rapporterade tidigare att olika längder av polymerer, polyetylenglykoler (PEGs), kunde särskiljas genom deras unika effekter på aktuella avläsningar i ett α-hemolysinprotein nanoporer på enstaka molekylnivå och utvecklade därefter en teori för metoden. Deras resultat ger proof-of-concept för enkelmolekylmasspektrometri. Kombinationen av SBS-konceptet med de distinkta nanopor-detekterbara elektroniska taggar för att märka DNA-byggstenar ledde till utvecklingen av den enmolekylära elektroniska Nano-SBS-metoden som beskrev den nuvarande Vetenskapliga rapporter artikel.
Som huvudförfattaren Dr. Shiv Kumar påpekar, "Nyheten i vårt tillvägagångssätt ligger i design och användning av fyra olika märkta nukleotider, som vid inkorporering av DNA-polymeras, släpp fyra olika storlekstaggar som skiljer sig från varandra på singelmolekylnivå när de passerar genom nanoporen. Detta tillvägagångssätt övervinner alla begränsningar som de små skillnaderna mellan de fyra nukleotiderna medför, en utmaning som de flesta nanopore-sekvenseringsmetoder har stått inför i decennier." Dessutom, tekniken är ganska flexibel; med PEG -taggar som prototyper, andra kemiska taggar kan väljas för att ge optimal separation i olika nanoporsystem.
Med vidareutveckling av denna Nano-SBS-metod, såsom användning av stora matriser av protein eller fasta nanoporer, detta system har potential att exakt sekvensera ett helt mänskligt genom snabbt och till låg kostnad, vilket gör det möjligt att använda den i rutinmässiga medicinska diagnoser.
