Vid hembiosyntes, det slutliga steget är införandet av järnhaltigt järn i protoporfyrin IX (PPIX) av enzymet ferrokelatas. Under fysiologiska förhållanden, små mängder zinkprotoporfyrin IX (ZnPP) bildas också. Koncentrationerna av ZnPP och PPIX i erytroida celler förändras karakteristiskt av tillstånd som påverkar tillgängligheten av järnhaltigt järn, öka mängden PPIX, eller minska den enzymatiska aktiviteten av ferrokelatas. Tyvärr, den vanliga HPLC-baserade kvantifieringsmetoden är tidskrävande och komplicerad. Alternativ, för, har visat sig vara för tekniskt krävande eller besvärliga för allmän adoption. För mätning av enbart ZnPP, en bärbar front-face fluorometer, hematofluorometern, är kommersiellt tillgänglig. Än, dess användning begränsas av en hög bakgrundsfluorescens av andra blodbeståndsdelar, vilket gör provtvättning oundviklig.
En forskargrupp ledd av Georg Hennig från Klinikum der Universität München (Tyskland) utvecklade nu en ny metod för samtidig kvantifiering av ZnPP och PPIX i otvättade blodprover. Den är baserad på excitation med dubbla våglängder för att effektivt eliminera bakgrundsfluorescens från andra blodbeståndsdelar. De erhållna resultaten var nära korrelerade med bestämningar med en referens HPLC-analys.
Nyckeln till framgång var valet av lämpliga excitationsvåglängder. Båda bör genomgå praktiskt taget identisk absorption och deras spektrala separation bör vara liten, så att penetrationsdjupen för fotonerna är väsentligen desamma. Excitationseffektiviteten för de fluoroforer som är ansvariga för autofluorescens bör endast skilja sig med en liten mängd mellan de två excitationsvåglängderna, så att subtraktion av emissionsspektra effektivt eliminerar autofluorescens. I kontrast, analytfluoroforen bör uppvisa en stor skillnad i excitationseffektivitet mellan dessa två excitationsvåglängder, så att skillnaden mellan emissionsspektra är stor och inte eliminerar analytens fluoroforsignal.
Detta är fallet för 425 nm (ZnPP-fluorescensexcitationsmaximum, emissionsmaximum vid 593 nm) och 407 nm som en motsvarande våglängd med identisk syresatt hemabsorption, men avsevärt lägre ZnPP-excitationseffektivitet. Dessutom, när excitationsvåglängden vid 407 nm närmar sig PPIX-excitationsmaximum vid 397 nm, emissionsspektrumet visar en uttalad PPIX-fluorescensemissionstopp, som finns vid 627 nm. Eftersom PPIX-excitationseffektiviteten är mycket lägre vid 425 nm, PPIX-fluorescensemissionstoppen elimineras inte i skillnadsspektrumet och kan utvärderas tillsammans med ZnPP-signalen.
Den nya metoden skulle enkelt och kostnadseffektivt kunna implementeras i en enhet för användning under fältförhållanden. Dessutom, det kan minska autofluorescens i vävnad som munslemhinnan in vivo, möjliggör icke-invasiva mätningar av ZnPP och PPIX. (Text bidragit av K. Maedefessel-Herrmann)
