Forskare har utvecklat ett nytt sätt att använda atomkraftsmikroskopi för att snabbt mäta de mekaniska egenskaperna hos celler på nanometerskala, ett framsteg som kan bana väg för bättre förståelse av immunsjukdomar och cancer.

I sin roll som barnläkare, Manish Butte, MD, PhD, kommer ofta att trycka och stöta en patients mage, känsla av abnormiteter - en svullen mjälte, en härdad lymfkörtel eller en ovanlig knöl i tarmarna eller levern. Det finns fortfarande vissa saker som bara kan plockas fram genom beröring, och Butte tror att denna uppfattning även gäller enskilda celler.

Ändå har forskarnas förmåga att sondera och mäta egenskaperna hos levande celler varit nästan obefintlig. Nyligen, ett team av Stanford-forskare och ingenjörer försökte rätta till denna obalans med en ny teknik för att snabbt kartlägga celler. De lyckades genom att konstruera ett stort framsteg inom en teknik som kallas atomkraftsmikroskopi, eller AFM, som i sig uppfanns i Stanford 1986.

En artikel som beskriver arbetet publicerades online den 11 november ACS Nano . Butte, en biträdande professor i pediatrisk immunologi, är senior författare. Huvudförfattarskapet delas av Andrew Wang, PhD, en före detta postdoktor i Buttes labb, och Karthik Vijayrhagavan, PhD, som var doktorand och medlem i mikrofotoniklabbet ledd av Olav Solgaard, PhD, professor i elektroteknik.

"Hur en cell känns - dess mekaniska egenskaper som påverkar hur den kommer i kontakt med andra celler och vävnader - är mycket viktigare än hur den ser ut, men tekniken var helt enkelt inte där för att tillåta oss att undersöka det, Butte sa. "Det finns mycket att lära av att studera mekaniken i en cell och dess strukturer precis under ytan."

Sättet Butte och hans kollegor använder AFM för att mäta de mekaniska egenskaperna hos celler liknar hur en byggare knackar med knogarna längs en gipsskiva, lyssnar efter förändringen i tonhöjd som kommer att berätta för henne att en träregel är på andra sidan. När en AFM-sond knackar på ytan av en cell, det vibrerar, och mönstret för dessa vibrationer, som ljudvågorna som reflekteras från dubben, ger mekanisk information om strukturerna i cellen som berörs.

Dock, befintliga AFM-sonder är relativt stora och, som ett resultat, okänslig för höga frekvenser, som kommunicerar mycket av nyckelinformationen om en cells inre. Stanford-teamets enhet kopplar ihop en mycket liten sond med en traditionell. Denna enhet gör att enheten kan känna av snabbare svängningar än konventionella enheter och, följaktligen, att ta mer detaljerade och mycket snabbare mätningar.

"Den största skillnaden mellan detta och tidigare atomkraftmikroskop är att vi kan mäta sondens påverkan på cellen mycket snabbt och få specifika avläsningar, medan typiska AFM helt enkelt ger ett genomsnitt. Detta tillåter oss att noggrant mäta några mycket mjuka material för första gången, sade Solgaard, som också är medförfattare till tidningen.

Nuvarande prober mäter cellulär styvhet genom att knacka mot cellen ungefär en eller två gånger per sekund - det snabbaste som de stora sonderna kan göra mätningar. Den lilla sonden, dock, kan enkelt göra detaljerade mätningar vid fem till 10, 000 tryck per sekund på grund av dess känslighet. Han liknade språnget i känslighet med skillnaden mellan att köra en Cadillac Escalade på vägen och att skjuta en Hot Wheel leksaksbil längs samma yta:"Den lilla Hot Wheel kommer att känna varje liten bula så mycket mer än den stora Cadillac."

"Vacker lösning"

AFM mäter sondens rörelse genom att studsa en laser från dess spets. När spetsen rör sig upp och ner, lasern reflekteras. Stanford-uppfinningen kopplar den lilla sonden med den stora med hjälp av en gaffelformad struktur som kallas ett interferometriskt gitter. Gittret producerar ett diffraktionsmönster baserat på den lilla sondens rörelser, och låter AFM bekvämt fånga sina mätningar.

"Vårt tips producerar faktiskt en andra signal, och det är det som gör att vi kan få mycket större detaljer. Ur ingenjörssynpunkt, det är väldigt enkelt, vacker lösning, " sade Solgaard, hänvisar till de diffrakterade signalerna från gittret.

Bäst av alla, lagets enhet kan kopplas direkt till befintliga AFM:er, potentiellt spara miljontals dollar på ny utrustning som annars skulle kunna spenderas på forskning. En ny AFM kan kosta så mycket som $500, 000, enligt Solgaard.

Målet är den cellulära motsvarigheten till Butte som trycker på ett barns mage.

"Vi vill studera cellstyvhet för att förstå vad som finns under ytan och hur celler är uppbyggda, " sa Wang.

Som en demonstration, laget mätte en del av en röd blodkropp, gör cirka 4 miljoner totala mätningar på cirka 10 minuter – allt utan att skada den känsliga cellulära exteriören.

"Samma mätningar skulle ha tagit mer än en månad att slutföra med konventionella atomkraftmikroskop, " sa Vijayraghavan. Tekniken är så snabb att teamet kunde skapa en serie time-lapse-bilder av en levande cell, var och en med bara sju minuters mellanrum, en tidigare ofattbar takt.

Potentiella applikationer

De praktiska tillämpningarna av enheten sträcker sig från grundläggande vetenskaplig förståelse av cellulär struktur till immunologi och onkologi. Vetenskaplig förståelse av de mekaniska krafterna som spelar i celler är så bristfälliga att fältet – som nu kallas mekanobiologi – verkligen är i sin linda, enligt Butte.

De mekaniska krafterna i kroppen kan komma från vävnader, som varierar i styvhet från mjukaste hjärnmaterial till styvare ben, från gravitationen, och även från tryckande och dragande rörelser från andra celler. Cancerceller gör sin miljö mekaniskt stel genom att utsöndra kemikalier som gör den extracellulära matrisen styv. Cancerceller tolkar också de mekaniska krafterna i en vävnad för att fatta beslut om tillväxt och metastaser. Överraskande återkopplingsslingor som denna verkar också förekomma för stamceller i benmärgen och under embryonal utveckling. Hur immunceller tolkar mekaniska krafter är fortfarande totalt okänt.

"Den lägst hängande frukten är cancer. Cancer är ofta stelare än normalt, friska vävnader och vi kan använda den kunskapen för att diagnostisera sjukdom. Men först, du måste ha bra data, som vår enhet tillhandahåller, " sa Wang. Han har redan använt en tidig form av den nya Stanford-sonden i pilotarbete på bröstcancerprover tagna från mastektomier.

För hans del, Butte planerar att använda snabb AFM för att studera immunförsvaret. Han hoppas kunna utforska varför annars sjukdomsbekämpande T-celler ofta förblir vilande en gång inuti en tumör. Han teoretiserar att den mekaniska stelheten i tumörvävnaden kan hindra T-celler från att fritt ta kontakt med cancerceller och från att utlösa deras cancerbekämpande funktioner. I huvudsak, tumören kan vara för trång för att T-cellerna ska fungera. I andra änden av styvhetsområdet, han tror att de mjuka mekaniska egenskaperna hos kroniskt inflammerade eller infekterade vävnader provocerar immunsystemet till överaktivitet, som autoimmunitet.

Det är en teori som ingen ännu har utforskat på grund av tekniska barriärer, som den snabba AFM kunde övervinna. Buttes labb har påbörjat en bred ansträngning för att koppla samman mekaniska krafter med immunsvar på molekylen, cell- och vävnadsfjäll. "Det finns så mycket vi inte vet om de mekaniska egenskaperna hos olika celltyper och sjuka vävnader. Nästan ingenting, faktiskt, " Sa Butte. "Det första steget är att sondera. Nu, Vi kan göra det."