Den bänkbara CFM-enheten, som består av själva CFM-enheten (överst), delar för att överföra kamerasignalen samt ett batteri (till höger), passar i två standardskopor av en gemensam laboratoriecentrifug som balanseras av motvikter i respektive motsatta hinkar. Kredit:Wyss Institute vid Harvard University.
Från spänningen av sammandragande muskelfibrer till hydrodynamiska påfrestningar i strömmande blod, molekyler i våra kroppar är föremål för en mängd olika mekaniska krafter som direkt påverkar deras form och funktion. Genom att analysera reaktionerna från enskilda molekyler under förhållanden där de upplever sådana krafter kan vi utveckla en bättre förståelse för många biologiska processer, och potentiellt, utveckla mer exakt verkande läkemedel. Men hittills har experimentell analys av enstaka molekylinteraktioner under våld varit dyra, tråkigt och svårt att utföra eftersom det kräver användning av sofistikerad utrustning, såsom ett atomkraftsmikroskop eller optisk pincett, som endast tillåter analys av en molekyl åt gången.
Nu, ett forskarlag under ledning av Wesley Wong vid Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering och Boston Children's Hospital har gjort stora framsteg genom att utveckla en billig metod som tillåter analys av kraftsvaren från tusentals liknande molekyler samtidigt. De rapporterar in Naturkommunikation hur programmerbara DNA-nanoswitchar kan användas i kombination med ett nydesignat miniatyriserat Centrifuge Force Microscope (CFM) som ett mycket tillförlitligt verktyg för att observera tusentals individuella molekyler och deras svar på mekaniska krafter parallellt.
"Detta nya kombinerade tillvägagångssätt kommer att tillåta oss och andra att undersöka hur enstaka molekylkomplex beter sig när de kastas ut ur sin jämvikt av den avstämbara kraft som genereras i vår nydesignade CFM. Genom att basera detta instrument på något som de flesta forskare redan har och använder— bänkcentrifugen – vi hoppas kunna göra mätningar av en molekylkraft tillgängliga för nästan alla, sa Wong, Ph.D., som är Wyss Institute Associate Faculty-medlem och studiens seniorförfattare. Han är också biträdande professor vid Harvard Medical School vid institutionerna för biologisk kemi &molekylär farmakologi och pediatrik, och utredare i programmet i cellulär och molekylär medicin vid Boston Children's Hospital.
Bilden på toppen visar en DNA-nanoswitch som bildar en slingad struktur när en bindning bildas mellan de bifogade reaktiva komponenterna (t.ex. receptor-ligandpar visas i rött och grönt); i ena änden är den fäst vid provbordet och i den andra till en pärla (överst). Genom att applicera centrifugalkrafter på kulan i CFM-enheten, bindningen mellan de reaktiva komponenterna kan brytas upprepade gånger, öppna upp slingan och öka längden på DNA-tjudet (nederst), möjliggör mycket tillförlitliga mätningar av molekylära interaktioner. I CFM, många pärlor kan förhöras parallellt, möjliggör mätningar av en molekyl med hög genomströmning (nedre till vänster). I videon längst ner till höger, kameran fångar dessa brotthändelser i realtid genom att registrera pärlan på en annan plats. Kredit:Wyss Institute vid Harvard University.
Tidigare ansträngningar ledda av Wong vid Rowland Institute vid Harvard introducerade den första CFM 2010, som var ett högspecialiserat instrument som utförde precisionskraftmätningar med hög genomströmning på enstaka molekyler genom att binda dem till pärlor och dra i dem med centrifugalkraft. I sin senaste CFM-iteration, Wong och hans team utvecklade ett sätt att utföra samma teknik med liknande precision med hjälp av ett litet billigt mikroskop tillverkat av lättmonterade element och 3D-printade delar som kan sättas in i den svängande hinken på en standard bänkcentrifug som finns i praktiskt taget alla biomedicinska forskningslaboratorier.
Dessutom, teamet ökade robustheten och noggrannheten i analysen genom att integrera tusentals så kallade DNA-nanoswitchar, linjära DNA-strängar med par av interagerande molekyler som är associerade med två sekvenser i mitten och som, dessutom, genom att binda till varandra skapa en intern DNA-loop; nanoswitcharnas ändar är bundna till ytan av provet på ena sidan och till pärlor på den andra.
"Genom att applicera ett definierat intervall av centrifugalkrafter på pärlorna kan vi provocera brytningen av molekylkomplexen som genererar de loopade DNA-strukturerna som kommer att registreras av den kamerakopplade linsen. Viktigt, Genom att använda DNA-nanoswitchar som en stabil ställning kan vi upprepa denna process flera gånger med samma molekyl under temperaturkontrollerade förhållanden, vilket avsevärt ökar vår noggrannhet när det gäller att bestämma den heterogenitet som en enda molekylär interaktion kan visa, sa Darren Yang, studiens första författare och en doktorand i Wongs team.
I framtida forskning, pärlassocierade DNA-nanoswitchar kan användas för att upprepade gånger sätta ihop och bryta många olika biomolekylära komplex och för att definiera de mekaniska krafterna som styr dem. "De integrerade DNA-nanoswitcharna är mycket modulära, och kan funktionaliseras med många olika biomolekyler i huvudsak på ett plug-and-play-sätt, för att göra det möjligt att studera en mängd olika molekylära interaktioner med hög genomströmning och tillförlitlighet, " tillade Wong.
Nästa, Wyss-forskarna planerar att använda sin DNA-nanoswitch-förstärkta miniatyr-CFM för att undersöka utvalda biomedicinskt relevanta och kraftberoende molekylära interaktioner som proteininteraktioner som styr blodpropp eller hörsel.
"Wongs team har skapat en ny teknologiplattform som avsevärt minskar kostnaden för analys av enskild molekylkraft och gör den allmänt tillgänglig för det vetenskapliga samfundet. Förutom att öka vår förståelse för grundläggande molekylstruktur-funktionsrelationer, det kan visa sig vara ett värdefullt verktyg för läkemedelsutveckling, " sa Wyss Institutes grundare Donald Ingber, M.D., Ph.D., som också är Judah Folkman-professor i vaskulär biologi vid Harvard Medical School och Vascular Biology-programmet vid Boston Children's Hospital, och professor i bioteknik vid SEAS.
