Forskare har utvecklat en ny förbättrad DNA -avbildningsteknik som kan undersöka strukturen hos enskilda DNA -strängar på nanoskala. Eftersom DNA är roten till många sjukdomsprocesser, tekniken kan hjälpa forskare att få viktig inblick i vad som går fel när DNA skadas eller när andra cellulära processer påverkar genuttryck.

Den nya avbildningsmetoden bygger på en teknik som kallas enmolekylmikroskopi genom att lägga till information om orienteringen och rörelsen för fluorescerande färgämnen fästa vid DNA-strängen.

W. E. Moerner, Stanford University, USA, är grundaren av en-molekylspektroskopi, en genombrottsmetod från 1989 som gjorde det möjligt för forskare att visualisera enskilda molekyler med optisk mikroskopi för första gången. Av 2014 års nobelpristagare för optisk mikroskopi bortom diffraktionsgränsen (Moerner, Hell &Betzig), Moerner och Betzig använde enstaka molekyler för att avbilda en tät uppsättning molekyler vid olika tidpunkter.

I The Optical Society's journal for high impact research, Optica , forskargruppen som leds av Moerner beskriver deras nya teknik och demonstrerar den genom att erhålla superupplösta bilder och orienteringsmätningar för tusentals enstaka fluorescerande färgmolekyler fästa vid DNA-strängar.

"Du kan tänka dig att dessa nya mätningar ger små dubbelhuvudpilar som visar orienteringen av molekylerna fästa längs DNA-strängen, "sa Moerner." Denna orienteringsinformation rapporterar om den lokala strukturen för DNA -baserna eftersom de begränsar molekylen. Om vi ​​inte hade denna orienteringsinformation skulle bilden bara vara en plats. "

Lägger till mer nanoskalainformation

En DNA -sträng är mycket lång, men smal sträng, bara några nanometer över. Enmolekylmikroskopi, tillsammans med fluorescerande färgämnen som fäster vid DNA, kan användas för att bättre visualisera denna lilla sträng. Tills nu, det var svårt att förstå hur dessa färgämnen var orienterade och omöjligt att veta om det fluorescerande färgämnet var fäst vid DNA:t på ett styvt eller något löst sätt.

Adam S. Backer, tidningens första författare, utvecklat ett ganska enkelt sätt att få orientering och rotationsdynamik från tusentals enskilda molekyler parallellt. "Vår nya bildteknik undersöker hur varje enskild färgämnesmolekyl som märker DNA:t är i linje med DNA:s mycket större struktur, "sa Backer." Vi mäter också hur vacklande var och en av dessa molekyler är, som kan berätta för oss om denna molekyl fastnar i en viss inriktning eller om den floppar runt under vår mätningssekvens. "

Den nya tekniken erbjuder mer detaljerad information än dagens så kallade "ensemble" -metoder, som genomsnitt orienteringarna för en grupp molekyler, och det är mycket snabbare än konfokalmikroskopitekniker, som analyserar en molekyl i taget. Den nya metoden kan till och med användas för molekyler som är relativt svaga.

Eftersom tekniken ger nanoskalainformation om själva DNA:t, det kan vara användbart för att övervaka förändringar av DNA -konformation eller skada på en viss region av DNA, vilket skulle dyka upp som förändringar i färgämnesmolekylernas orientering. Det kan också användas för att övervaka interaktioner mellan DNA och proteiner, som driver många cellulära processer.

30, 000 enkelmolekylorienteringar

Forskarna testade den förbättrade DNA -avbildningstekniken genom att använda den för att analysera ett interkalerande färgämne; en typ av fluorescerande färgämne som glider in i områdena mellan DNA -baser. I ett typiskt avbildningsexperiment, de förvärvar upp till 300, 000 enskilda molekylplatser och 30, 000 enkelmolekyl orienteringsmätningar på drygt 13 minuter. Analysen visade att de enskilda färgämnesmolekylerna var orienterade vinkelrätt mot DNA -strängens axel och att medan molekylerna tenderade att orientera sig i denna vinkelräta riktning, de rörde sig också runt inom en begränsad kon.

Utredarna utförde sedan en liknande analys med hjälp av en annan typ av fluorescerande färgämne som består av två delar:en del som fäster vid sidan av DNA:t och en fluorescerande del som är ansluten via en diskettbindare. Den förbättrade DNA -avbildningstekniken upptäckte denna diskett, visar att metoden kan vara användbar för att hjälpa forskare att förstå, på molekyl för molekylbasis, om olika etiketter fäster till DNA på ett mobilt eller fast sätt.

I tidningen, forskarna visade en rumslig upplösning på cirka 25 nanometer och enmolekylära orienteringsmätningar med en noggrannhet på cirka 5 grader. De mätte också rotationsdynamiken, eller diskett, av enkelmolekyler med en noggrannhet på cirka 20 grader.

Hur det fungerar

För att skaffa information om en molekyl orientering, forskarna använde en välstuderad teknik som lägger till ett optiskt element som kallas en elektrooptisk modulator till enkelmolekylmikroskopet. För varje kameraram, denna enhet ändrade polariseringen av laserljuset som används för att belysa alla fluorescerande färgämnen.

Since fluorescent dye molecules with orientations most closely aligned with the laser light's polarization will appear brightest, measuring the brightness of each molecule in each camera frame allowed the researchers to quantify orientation and rotational dynamics on a molecule-by-molecule basis. Molecules that switched between bright and dark in sequential frames were rigidly constrained at a particular orientation while those that appeared bright for sequential frames were not rigidly holding their orientation.

"If someone has a single-molecule microscope, they can perform our technique pretty easily by adding the electro-optic modulator, " said Backer. "We've used fairly standard tools in a slightly different way and analyzed the data in a new way to gain additional biological and physical insight."