En musfibroblastcell avbildad på en metayta gjord av guldnanopartiklar under ett mikroskop för total intern reflektion fluorescens (TIRF) uppvisar förbättrad och begränsad emission från ljusemitterande paxillinprotein vid fokala vidhäftningar nära membranet. Forskare vid Kyushu University har visat att sådana metasytor kan användas med konventionella fluorescensmikroskop som en enkel väg för att förbättra upplösningen till nära diffraktionsgränsen. Användningen av TIRF-förhållanden hjälper till att minska ströutsläpp från djupt inuti cellen för att ytterligare förbättra kontrasten mellan strukturer nära metaytan. Kredit:Kaoru Tamada, Kyushu universitet
I strävan att avbilda extremt små strukturer och fenomen med högre precision, forskare har tänjt på gränserna för optisk mikroskopupplösning, men dessa framsteg kommer ofta med ökade komplikationer och kostnader.
Nu, Forskare i Japan har visat att en glasyta inbäddad med självmonterade guldnanopartiklar kan förbättra upplösningen med liten extra kostnad även med ett konventionellt bredfältsmikroskop, underlättar högupplöst fluorescensmikroskopi som kan avbilda levande celler i hög hastighet.
Eftersom optiska mikroskop förstorar ljuset för att få detaljerade bilder av en struktur, storleken på föremål som kan urskiljas har länge varit begränsad av diffraktion – en egenskap hos ljus som gör att det sprids när det passerar genom en öppning.
Forskare har utvecklat tekniker för att övervinna dessa gränser med mycket avancerade optiska system, men många av dem är beroende av användningen av starka lasrar, som kan skada eller till och med döda levande celler, och skanning av provet eller bearbetning av flera bilder, som hämmar realtidsavbildning.
"Närare tekniker kan producera fantastiska bilder, men många av dem kräver högspecialiserad utrustning och är oförmögna att observera levande cellers rörelse, " säger Kaoru Tamada, framstående professor vid Kyushu University's Institute for Materials Chemistry and Engineering.
Avbilda celler med hjälp av fluorescensmikroskopimetoder i realtid, Tamada och hennes grupp fann att de kunde förbättra upplösningen under ett konventionellt bredfältsmikroskop till nära diffraktionsgränsen bara genom att ändra ytan under cellerna.
Vid fluorescensmikroskopi, cellstrukturer av intresse är taggade med molekyler som absorberar energi från inkommande ljus och, genom fluorescensprocessen, återsända det som ljus av en annan färg, som samlas in för att bilda bilden.
Även om celler vanligtvis avbildas på vanligt glas, Tamadas grupp belade glasytan med ett självmonterat lager av guld-nanopartiklar täckt med ett tunt lager av kiseldioxid, skapa en så kallad metayta med speciella optiska egenskaper.
Endast 12 nm i diameter, de organiserade metallnanopartiklarna uppvisar ett fenomen som kallas lokaliserad ytplasmonresonans, som tillåter metaytan att samla energi från närliggande ljusemitterande molekyler för högeffektiv återemission, vilket ger ökad emission begränsad till den 10 nm tjocka nanopartikelytan.
En musfibroblastcell avbildad på en metayta gjord av guldnanopartiklar under en bredfältsfluorescensmikroskop uppvisar förbättrad och begränsad emission från ljusemitterande paxillinprotein vid fokala vidhäftningar nära membranet. Forskare vid Kyushu University har visat att sådana metasytor kan användas med konventionella fluorescensmikroskop som en enkel väg för att förbättra upplösningen till nära diffraktionsgränsen. Belysning av provet vinkelrätt mot metaytan gör att cellkroppen grovt sett kan ses som svag emission medan paxillin avbildas som ljusa fläckar. Kredit:Kaoru Tamada, Kyushu universitet
"Genom att introducera nanopartiklarna, vi har effektivt skapat ett ljusemitterande plan som bara är flera nanometer tjockt, " förklarar Tamada. "Eftersom ljuset av intresse sänds ut från ett så tunt lager, vi kan bättre fokusera på det."
Ytterligare fördelar uppstår genom att energiöverföringen till metaytan är snabb, ytterligare lokalisera emissionspunkter genom att minska diffusion, och metaytans höga brytningsindex, vilket hjälper till att förbättra upplösningen enligt Abbes diffraktionsgräns.
Med hjälp av metaytan, forskarna avbildade i realtidsmusceller kända som 3T3-fibroblaster som var genetiskt framställda för att producera ett protein som heter paxillin som modifieras för att avge grönt ljus när det exciteras. Paxillin spelar en nyckelroll för att skapa fokala vidhäftningar – punkter där molekyler i cellmembranet interagerar med omvärlden.
Belyser hela provet med laserljus vinkelrätt mot ytan, forskarna kunde avbilda förändringar i paxillin nära cellmembranet med en högre upplösning med hjälp av metaytan istället för glas.
Luta belysningsljuset för att uppnå total intern reflektion, forskarna kunde få bilder med ännu högre kontrast eftersom det mesta av belysningsljuset reflekteras från ytan med endast en liten mängd som når cellsidan, därigenom minskar ströemissionen som produceras av belysning som penetrerar djupt in i cellen.
Analys av bilder inspelade var 500:e millisekund med en superupplöst digitalkamera avslöjade tydliga skillnader i intensitet över fläckar som bara täcker några få pixlar, vilket indikerar att upplösningen var cirka 200 nm - nära diffraktionsgränsen.
Celler kunde också avbildas längre på metaytan eftersom emissionen förbättrades trots en lägre ingångsenergi, vilket minskar cellskador över tiden.
"Metasytor är ett lovande alternativ för att förbättra upplösningen för forskare runt om i världen som använder konventionella optiska mikroskop som de redan har, " kommenterar Tamada.
Förutom att fortsätta att förbättra ytorna för användning med konventionella mikroskop, forskarna undersöker också vilka fördelar de kan ha för mer sofistikerade mikroskopsystem.
