Kredit:Pixabay/CC0 Public Domain
Inuti en levande cell är proteiner och andra molekyler ofta tätt packade tillsammans. Dessa täta kluster kan vara svåra att avbilda eftersom de fluorescerande etiketterna som används för att göra dem synliga inte kan kila sig in mellan molekylerna.
MIT-forskare har nu utvecklat ett nytt sätt att övervinna denna begränsning och göra dessa "osynliga" molekyler synliga. Deras teknik gör det möjligt för dem att "avtränga" molekylerna genom att expandera ett cell- eller vävnadsprov innan de märker molekylerna, vilket gör molekylerna mer tillgängliga för fluorescerande taggar.
Denna metod, som bygger på en allmänt använd teknik känd som expansionsmikroskopi som tidigare utvecklats vid MIT, bör göra det möjligt för forskare att visualisera molekyler och cellulära strukturer som aldrig tidigare setts.
"Det börjar bli uppenbart att expansionsprocessen kommer att avslöja många nya biologiska upptäckter. Om biologer och läkare har studerat ett protein i hjärnan eller ett annat biologiskt prov, och de märker det på det vanliga sättet, kanske de saknar hela kategorier av fenomen ," säger Edward Boyden, Y. Eva Tan-professorn i neuroteknik, professor i biologisk ingenjörsteknik och hjärn- och kognitionsvetenskap vid MIT, utredare vid Howard Hughes Medical Institute och medlem av MIT:s McGovern Institute for Brain Research och Koch Institute for Integrative Cancerforskning.
Med denna teknik visade Boyden och hans kollegor att de kunde avbilda en nanostruktur som finns i neuronernas synapser. De avbildade också strukturen av Alzheimers-kopplade amyloid beta-plack mer detaljerat än vad som varit möjligt tidigare.
"Vår teknik, som vi kallade expansionsavslöjande, möjliggör visualisering av dessa nanostrukturer, som tidigare förblev dolda, med hjälp av hårdvara som är lätt tillgänglig i akademiska laboratorier", säger Deblina Sarkar, biträdande professor i Media Lab och en av huvudförfattarna till studien .
Seniorförfattarna till studien är Boyden; Li-Huei Tsai, chef för MIT:s Picower Institute for Learning and Memory; och Thomas Blanpied, professor i fysiologi vid University of Maryland. Andra huvudförfattare inkluderar Jinyoung Kang, en MIT postdoc, och Asmamaw Wassie, en nyligen MIT Ph.D. mottagare. Studien visas idag i Nature Biomedical Engineering .
Att minska trängseln
Att avbilda ett specifikt protein eller annan molekyl inuti en cell kräver att den märks med en fluorescerande tagg som bärs av en antikropp som binder till målet. Antikroppar är cirka 10 nanometer långa, medan typiska cellulära proteiner vanligtvis är cirka 2 till 5 nanometer i diameter, så om målproteinerna är för tätt packade kan antikropparna inte komma åt dem.
Detta har varit ett hinder för traditionell avbildning och även för den ursprungliga versionen av expansionsmikroskopi, som Boyden utvecklade först 2015. I den ursprungliga versionen av expansionsmikroskopi fäste forskare fluorescerande etiketter på molekyler av intresse innan de expanderade vävnaden. Märkningen gjordes först, delvis för att forskarna var tvungna att använda ett enzym för att hacka upp proteiner i provet så att vävnaden kunde expanderas. Detta innebar att proteinerna inte kunde märkas efter att vävnaden expanderats.
För att övervinna det hindret var forskarna tvungna att hitta ett sätt att expandera vävnaden samtidigt som de lämnade proteinerna intakta. De använde värme istället för enzymer för att mjuka upp vävnaden, vilket gjorde att vävnaden kunde expandera 20 gånger utan att förstöras. Sedan kunde de separerade proteinerna märkas med fluorescerande taggar efter expansion.
Med så många fler proteiner tillgängliga för märkning kunde forskarna identifiera små cellulära strukturer inom synapser, kopplingarna mellan neuroner som är tätt packade med proteiner. De märkte och avbildade sju olika synaptiska proteiner, vilket gjorde det möjligt för dem att i detalj visualisera "nanokolonner" bestående av kalciumkanaler i linje med andra synaptiska proteiner. Dessa nanokolonner, som tros bidra till att effektivisera synaptisk kommunikation, upptäcktes först av Blanpieds labb 2016.
"Denna teknik kan användas för att svara på många biologiska frågor om dysfunktion i synaptiska proteiner, som är involverade i neurodegenerativa sjukdomar," säger Kang. "Hittills har det inte funnits något verktyg för att visualisera synapser särskilt bra."
Nya mönster
Forskarna använde också sin nya teknik för att avbilda beta-amyloid, en peptid som bildar plack i hjärnan hos patienter med Alzheimers sjukdom. Med hjälp av hjärnvävnad från möss fann forskarna att amyloid beta bildar periodiska nanokluster, som inte hade setts tidigare. Dessa kluster av amyloid beta inkluderar också kaliumkanaler. Forskarna hittade också amyloida betamolekyler som bildade spiralformade strukturer längs axoner.
"I den här artikeln spekulerar vi inte i vad den biologin kan betyda, men vi visar att den existerar. Det är bara ett exempel på de nya mönster som vi kan se", säger Margaret Schroeder, en doktorand vid MIT som är också författare till tidningen.
Sarkar säger att hon är fascinerad av de biomolekylära mönster i nanoskala som denna teknik avslöjar. "Med en bakgrund inom nanoelektronik har jag utvecklat elektroniska kretsar som kräver extremt exakt uppriktning, i nanofab. Men när jag ser att i vår hjärna har Moder Natur arrangerat biomolekyler med sådan precision i nanoskala, det får mig verkligen att bli förvirrad", säger hon.
Boyden och hans gruppmedlemmar arbetar nu med andra laboratorier för att studera cellulära strukturer som proteinaggregat kopplade till Parkinsons och andra sjukdomar. I andra projekt studerar de patogener som infekterar celler och molekyler som är involverade i åldrandet i hjärnan. Preliminära resultat från dessa studier har också avslöjat nya strukturer, säger Boyden.
"Gång på gång ser man saker som verkligen är chockerande", säger han. "Det visar oss hur mycket vi saknar med klassisk oexpanderad färgning."
Forskarna arbetar också med att modifiera tekniken så att de kan avbilda upp till 20 proteiner åt gången. De arbetar också med att anpassa sin process så att den kan användas på mänskliga vävnadsprover.
Sarkar och hennes team, å andra sidan, utvecklar små trådlöst drivna nanoelektroniska enheter som kan distribueras i hjärnan. De planerar att integrera dessa enheter med expansionsavslöjande. "Detta kan kombinera intelligensen hos nanoelektroniken med nanoskopisk förmåga hos expansionsteknik, för en integrerad funktionell och strukturell förståelse av hjärnan," säger Sarkar. + Utforska vidare
