När forskare har undersökt livets mysterier ner till mindre och mindre skalor, har de uppfunnit verktyg som hjälper dem att förstå vad de observerar. Att fastställa identiteten för DNA- och RNA-molekyler har nu blivit vanligt tack vare den kommersiella utvecklingen av nästa generations sekvenseringsteknologier, men detsamma gäller ännu inte för proteiner, som är kritiskt viktiga aktörer i nästan alla biologiska processer. Proteiner är mycket mer komplexa än DNA och RNA och är ofta kemiskt modifierade, vilket gör målet att enkelt identifiera enskilda proteiner i ett prov (enkelmolekyls proteomik) utmanande att uppnå.

Nu har forskare som arbetar vid Molecular Robotics Initiative inom Wyss Institute vid Harvard University, Blavatnik Institute vid Harvard Medical School (HMS) och Boston Children's Hospital (BCH) använt DNA, själva livets grundläggande saker, för att skapa vad som kan vara världens minsta linjal för att mäta proteiner.

Den här tekniken, kallad "DNA Nanoswitch Calipers" (DNC), gör det möjligt för forskare att utföra avståndsmätningar på enstaka peptider (proteinernas byggstenar) med hög precision genom att applicera små mängder kraft. Genom att snabbt göra många avståndsmätningar på samma molekyl skapar DNC ett unikt "fingeravtryck" som kan användas för att identifiera det i efterföljande experiment. Prestationen rapporteras i Nature Nanotechnology .

"När du försöker förstå något inom biologi finns det två huvudsakliga undersökningsmetoder:du kan observera ditt ämne i dess naturliga tillstånd, eller så kan du störa det och se hur det reagerar. Observationer kan ge massor av fantastisk biologisk information, men ibland är det bästa sättet att lära sig om någonting att fysiskt interagera med det, säger den korresponderande författaren Wesley Wong, Ph.D., en associerad fakultetsmedlem vid Wyss Institute och docent vid HMS som också är utredare vid BCH . "Att bestämma mönstret för aminosyror i en peptidmolekyl genom att applicera kraft är ett nytt paradigm i den pågående vetenskapliga strävan efter tekniker som gör det möjligt för oss att sekvensera proteiner lika enkelt som vi för närvarande sekvenserar DNA."

Använd kraften

DNC är baserad på den underliggande teknologin för DNA-nanoswitchen:en enkel DNA-sträng med molekylära "handtag" fästa vid flera punkter längs dess längd. När två av dessa handtag binder till varandra skapar de en slinga i DNA-strängen och strängens totala längd förkortas. När kraft appliceras för att dra isär handtagen, sträcker sig strängen tillbaka till sin ursprungliga längd. Skillnaden mellan längden på strängen i dess ögla och oögla tillstånd återspeglar slingans storlek, och därmed avståndet mellan handtagen.

Forskargruppen insåg att de kunde ta DNA-nanoswitchar ett steg längre:om de istället konstruerade handtagen för att binda till en biomolekyl, skulle handtagen effektivt kunna "nypa" molekylen mellan sig som de två spetsarna på en bromsok, snarare än att binda till var och en Övrig. Genom att mäta hur tillägget av målmolekylen mellan handtagen förändrade den totala längden av DNA-nanoswitchen i dess loopade kontra oloopade tillstånd, antog teamet att de effektivt kunde mäta storleken på molekylen.

"På vissa sätt utnyttjar DNA-nanoswitchar en av de mest klassiska, mekaniska metoderna för att mäta objekt:bara applicera kraft på något och se hur det förändras som svar", säger medförfattaren Darren Yang, en postdoktor vid Wyss Institute och BCH. "Det är ett tillvägagångssätt som vi inte riktigt har sett användas inom området för enmolekylär proteomik, eftersom att applicera kraft på så små föremål är otroligt utmanande. Men vi klarade utmaningen."

För att omvandla sin idé om en ny kraftbaserad mätteknik till verklighet, fäste Yang och hans kollegor först två olika typer av handtag till en målmolekyl:ett "starkt" handtag för att ordentligt förankra molekylen i ena änden av DNC, och flera "svaga" handtag som skulle kunna fästa i den andra änden av DNC:n. De band sedan båda ändarna av DNC:n till två "optiskt fångade" pärlor upphängda i laserstrålar. Genom att flytta pärlorna närmare varandra inducerade de ett av målmolekylens svaga handtag att binda till DNC, vilket skapade ett loopat tillstånd. När de sedan ökade kraften genom att flytta pärlorna längre isär, släppte det svaga handtaget så småningom sin bindning och återförde DNC:n till dess längre, oögla tillstånd.

Teamet testade först denna teknik på enkla, enkelsträngade DNA-molekyler (ssDNA) och bekräftade att förändringen i avståndsmätningar mellan DNC:s loopade och oloopade tillstånd direkt korrelerade med längden på målmolekylen. Dessa längdförändringar kunde mätas med precision på ångströmsnivå (det är tio gånger mindre än bredden på en dubbelspiral med DNA), vilket möjliggör identifiering av förändringar i längd så små som för en enskild nukleotid.

Eftersom målmolekylen innehåller flera svaga handtag som kan binda till DNC, skapar upprepade cykler av bindning och brytning av dessa handtag en serie avståndsmätningar mellan det starka handtaget och de svaga handtagen som är unika för varje uppmätt molekyl. Detta "fingeravtryck" kan användas för att identifiera en känd molekyl i ett prov, eller för att sluta sig till strukturell information om en okänd molekyl.

Undersöka proteiner

Efter att ha bekräftat att DNC ​​på ett tillförlitligt sätt kunde mäta storleken på DNA-molekyler, flyttade forskarna fokus till sitt verkliga mål:proteiner. De designade en syntetisk peptid (en kort kedja av aminosyror) med en känd längd och sekvens och upprepade experimentet och fäste den vid ena änden av DNC via det starka handtaget och upprepade gånger fästa och bryta bindningarna mellan dess svaga handtag och DNC:n genom att applicera olika mängder kraft. De fann att alla avstånd som deras verktyg mätte mellan de starka och svaga handtagen matchade de förväntade avstånden baserat på längden på DNC och längden på aminosyrorna i peptiden. De fick också liknande resultat när de använde DNC för att mäta en naturligt förekommande linjäriserad peptid som heter NOXA BH3.

Denna process genererade också unika mätfingeravtryck för varje peptid. Teamet skapade en datormodell för att förutsäga hur många mänskliga proteiner som kunde identifieras unikt med denna metod, och fann att över 75 % av proteinerna i en vanlig proteindatabas kunde identifieras via fingeravtryck med en sannolikhet på minst 90 %.

"Vi blev faktiskt lite förvånade över hur väl den här tekniken fungerade", säger den första författaren Prakash Shrestha, Ph.D., en postdoktor vid Wyss Institute och BCH. "Optisk pincett har funnits i decennier och cirkulerande DNA mellan ett loopat och oloopat tillstånd har funnits i cirka 10 år, och vi var inte säkra på om vi kunde få tillräckligt högupplösta mätningar genom att kombinera dessa idéer. Men det visade sig att dessa fingeravtryck är mycket effektiva för att identifiera proteiner."

Att identifiera enstaka proteinmolekyler är en imponerande bedrift i sig, men att kunna göra det för flera proteiner samtidigt är den sanna heliga gralen för proteomik med en enda molekyl. Teamet visade vidare att genom att ersätta de optiska pärlorna med ett magnetiskt pincettsystem kunde de utföra mätningar på flera olika peptider parallellt, samt bestämma de relativa koncentrationerna av olika molekyler.

"Enkelmolekyls proteomik är fortfarande till stor del en dröm på grund av utmaningar i skalning och upplösning. Vårt nuvarande arbete visar att kraftbaserad sekvensfingeravtryck har potentialen att förverkliga den här drömmen", säger medkorrespondent författare William Shih, Ph.D. , en Core Faculty Member vid Wyss Institute och professor vid HMS och Dana-Farber Cancer Institute. "Vår ultimata ambition är att effektivt läsa inte bara proteinsekvenser utan även proteinstrukturer på ett sätt med hög genomströmning."

Forskarnas nästa steg mot det målet är att validera deras bromsok för strukturella mätningar med låg kraft på vikta proteiner och deras komplex, undersöka deras potentiella användning för strukturell biologi och proteomik. De arbetar också med att öka teknikens genomströmning för att ytterligare påskynda analysen av blandade prover.

"Denna forskning integrerar molekylär biofysik med banbrytande DNA-nanoteknik som var banbrytande här vid Wyss Institute för att tillåta oss att interagera med och analysera biologiska molekyler på ett verkligt nytt sätt. När William och Wesley först ställde denna idé som en kärnutmaning för de nybildade Molecular Robotics Initiative, det verkade verkligen som science fiction, men det är precis den typen av projekt vi vill ta oss an på Wyss. Jag är mycket stolt över teamet för att de har gjort den här tekniken till verklighet – den har potential att förändras totalt. hur vi gör vetenskap och utvecklar terapier", säger Wyss grundare Don Ingber, M.D., Ph.D., som också är Judah Folkman professor i vaskulär biologi vid Harvard Medical School och BCH, och professor i bioteknik vid Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences. + Utforska vidare

Demokratisering av enkelmolekylär kraftanalys med hög genomströmning