Forskare vid det brasilianska centret för forskning i energi och material (CNPEM) har genmanipulerat en svamp för att producera en cocktail av enzymer som bryter ner kolhydraterna i biomassa, som sockerrörsskräp (toppar och blad) och bagasse, till jäsbart socker för industriellt effektiv omvandling till biobränsle.

Utvecklingen av billiga enzymcocktails är en av de största utmaningarna för att producera andra generationens etanol.

Andra generationens biobränslen tillverkas av olika typer av icke-livsmedelsbiomassa, inklusive jordbruksrester, träflis och spill matolja. CNPEM-forskargruppens process banar väg för optimerad användning av sockerrörsrester för att producera biobränslen.

Svampen Trichoderma reesei är en av de mest produktiva producenterna av växtcellväggsnedbrytande enzymer och används flitigt inom bioteknikindustrin. För att öka sin produktivitet som biofabrik för enzymcocktailen i fråga, forskarna introducerade sex genetiska modifieringar i RUT-C30, en allmänt tillgänglig stam av svampen. De patenterade processen och rapporterade den i en artikel publicerad i tidskriften Bioteknik för biobränslen .

"Svampen modifierades rationellt för att maximera produktionen av dessa enzymer av biotekniskt intresse. Genom att använda genredigeringstekniken CRISPR/Cas9, vi modifierade transkriptionsfaktorer för att reglera uttrycket av gener associerade med enzymerna, raderade proteaser som orsakade problem med enzymcocktailens stabilitet, och tillsatt viktiga enzymer svampen saknar i naturen. Som ett resultat, vi kunde tillåta svampen att producera en stor mängd enzymer från agroindustriellt avfall, en billig och riklig råvara i Brasilien, " Mario T. Murakami, Vetenskaplig chef för CNPEM:s Biorenewables Laboratory (LNBR), berättade för Agência FAPESP.

Cirka 633 miljoner ton sockerrör bearbetas per skörd i Brasilien, genererar årligen 70 miljoner ton sockerrör (torr massa), enligt National Food Supply Company (CONAB). Detta avfall är underutnyttjat för produktion av bränsleetanol.

Murakami betonade att praktiskt taget alla enzymer som används i Brasilien för att bryta ner biomassa importeras från ett fåtal utländska producenter som håller tekniken under affärshemlighetsskydd. I detta sammanhang, den importerade enzymcocktailen kan representera så mycket som 50 % av ett biobränsles produktionskostnad.

"Under det traditionella paradigmet, årtionden av studier behövdes för att utveckla en konkurrenskraftig enzymcocktailproduktionsplattform, sade han. Dessutom, cocktailsna kunde inte erhållas enbart med syntetiska biologiska tekniker från allmänt tillgängliga stammar eftersom producenterna använde olika metoder för att utveckla dem, som adaptiv evolution, exponera svampen för kemiska reagenser, och inducering av genomiska mutationer för att välja den mest intressanta fenotypen. Nu, dock, tack vare avancerade genredigeringsverktyg som CRISPR/Cas9, vi har lyckats etablera en konkurrenskraftig plattform med bara några rationella modifieringar på två och ett halvt år."

Bioprocessen som utvecklats av CNPEM-forskarna producerade 80 gram enzymer per liter, den högsta experimentellt stödda titern som hittills rapporterats för T. reesei från ett billigt sockerbaserat råmaterial. Detta är mer än dubbelt så hög koncentration som tidigare rapporterats i den vetenskapliga litteraturen för svampen (37 gram per liter).

"En intressant aspekt av den här forskningen är att den inte var begränsad till labbet, Murakami sa. "Vi testade bioprocessen i en semi-industriell produktionsmiljö, skala upp det för en pilotanläggning för att bedöma dess ekonomiska genomförbarhet."

Även om plattformen var anpassad för produktion av cellulosaetanol från sockerrörsrester, han lade till, det kan bryta ner andra typer av biomassa, och avancerade sockerarter kan användas för att producera andra bioförnybara energikällor som plast och mellanliggande kemikalier.

Ny enzymklass

Processen var det praktiska resultatet (i termer av industriell tillämpning) av omfattande forskning utförd av LNBR för att utveckla enzymer som kan bryta ner kolhydrater. I en annan studie stödd av FAPESP och publicerad i Naturens kemiska biologi , forskarna avslöjade sju nya enzymklasser som framför allt finns i svampar och bakterier.

De nya enzymerna tillhör familjen glykosidhydrolas (GH). Enligt Murakami, dessa enzymer har betydande potential för tillämpningar inte bara inom biobränslen utan även inom medicin, livsmedelsförädling och textilier, till exempel. Enzymerna kommer att inspirera till nya industriella processer genom att utnyttja de olika sätt på vilka naturen bryter ner polysackarider (kolhydrater som består av många enkla sockerarter).

Dessa enzymer bryter ner betaglukaner, några av de vanligaste polysackariderna som finns i cellväggarna hos spannmål, bakterier och svampar, och en stor del av världens tillgängliga biomassa, indikerar enzymernas potentiella användning i livsmedelskonserveringsmedel och textilier. När det gäller biobränslen, nyckelegenskapen är deras förmåga att smälta material rikt på vegetabiliska fibrer.

"Vi satsade på att studera naturens mångfald i nedbrytande polysackarider och hur denna kunskap kan tillämpas på processer i olika industrier, ", sade Murakami. "Förutom upptäckten av nya enzymer, en annan viktig aspekt av denna forskning är likhetsnätverkets tillvägagångssätt som vi använder för att producera systematisk och djupgående kunskap om denna enzymfamilj. Tillvägagångssättet gjorde det möjligt för oss att börja från början och på relativt kort tid, komma fram till den mest studerade familjen av enzymer som är aktiva på beta-1, 3-glukaner hittills, med information tillgänglig om specificitet och verkansmekanismer."

Huvudkriteriet för att klassificera enzymer är vanligtvis fylogeni, dvs. molekylens evolutionära historia, medan CNPEM-forskare fokuserar på funktionalitet.

"Tack vare framstegen inom DNA-sekvenseringsteknik, vi har nu många kända genetiska sekvenser och en väletablerad förmåga att studera och karakterisera molekyler och enzymer vad gäller deras funktionalitet. Som ett resultat, vi har kunnat förfina likhetsnätverkets metodik och använda den för första gången för att studera enzymer som är aktiva på polysackarider, " sa Murakami.

Genom att använda likhetsnätverket, gruppen klassificerade sju underfamiljer av enzymerna baserat på funktionalitet. Karakterisera minst en medlem av varje underfamilj, forskarna fick i systematiska termer tillgång till mångfalden av molekylära strategier för nedbrytning av beta-glukaner som finns i tusentals medlemmar av enzymfamiljen.

Biokemisk tour de force

Fylogenetisk analys fokuserar på DNA-regioner som har bevarats över tiden, medan klassificering efter funktionalitet baseras på icke-konserverade regioner associerade med funktionell differentiering. "Detta gav oss effektivitet och gjorde det möjligt för oss att gruppera mer än 1, 000 sekvenser i endast sju undergrupper eller klasser med samma funktion, " sa Murakami.

Eftersom tillvägagångssättet var nytt, forskarna utförde flera andra studier för att dubbelkolla och validera klassificeringsmetoden. Från de sju grupperna av enzymer som kan bryta ned polysackarider, de fick 24 helt nya strukturer, inklusive olika substrat-enzymkomplex, anses vara avgörande för att tillhandahålla information för att hjälpa till att förstå de inblandade handlingsmekanismerna.

Studien omfattade funktionella och strukturella analyser för att förstå hur dessa enzymer verkar på de berörda kolhydraterna. "Polysackarider finns i dussintals konfigurationer och är kapabla till många typer av kemiska bindningar, ", sade Murakami. "Vi ville observera exakt vilka kemiska bindningar och arkitekturer känns igen av varje enzym. Av denna anledning, det måste vara en multidisciplinär studie, kombinerar strukturella och funktionella data som stöds av analys med masspektrometri, spektroskopi, mutagenes och diffraktionsexperiment för att belysa atomstrukturen."

I avsnittet "Nyheter och vyer" i samma nummer av Naturens kemiska biologi , Professor Paul Walton, ordförande för biooorganisk kemi vid University of York i Storbritannien, rankade glykosidhydrolasstudien som en "biokemisk 'tour de force'" för sitt innovativa tillvägagångssätt och berömde dess "enorma insikter", tillägger att forskarna kunde "uttrycka och isolera exemplar från varje klass [av enzymer] för att undersöka om skillnaderna i sekvenser mellan klasserna återspeglades i deras strukturer och aktiviteter".