En cells genetiska ritning är kodad inom sitt genetiska material eller DNA. Eftersom DNA: n aldrig lämnar cellens kärna, för att denna information ska komma in i cytoplasman där andra proteiner och biokemiska komponenter finns, är det nödvändigt att först transkribera DNA-värdet i messenger RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Detta mRNA blir då översatt till proteiner som utför många funktioner i cellen. För att detektera eller kvantifiera mycket sällsynta mRNA, göra prober för mikroarrays eller konstruera bibliotek av komplementära DNA-molekyler måste mRNA isoleras. Emellertid utesluter total RNA (dvs all RNA i en cell) extraktion och efterföljande mRNA-isolering inte ömsesidigt processer; den första måste utföras för att mRNA ska extraheras.
Isolering av mRNA från total RNA
TRIzolhomogenisering: Totalt RNA inkluderar all mRNA, överför RNA, ribosomal RNA och andra icke-kodande RNA . För att separera dessa från andra cellkomponenter förstörs cellen först för att släppa ut dess innehåll. Detta görs genom resuspenderande celler som pelleteras genom centrifugering (spinning vid höga hastigheter) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andra versioner av TRIzol (som Ambion's TRI Reagent) fungerar på samma sätt.
Total RNA-isolering: En serie centrifugeringar används för att separera de olika komponenterna (proteiner, DNA, RNA) i cellen eller i faser , inom suspensionen. Den övre, gulfärgade fasen består av fett och kan kasseras. Den önskade fasen är tonad röd, innehåller den totala RNA och bibehålls. Efter utförande av en fenol-kloroformutvinning och en serie av alkoholvaskar med användning av isopropanol och etanol kan RNA pelleteras för mRNA-isolering. Lägg till RNase-hämmare för att förhindra att detta enzym försämrar total RNA.
mRNA-extraktion: Det är vanligt att använda ett kit för att isolera mRNA, eftersom hemlagade labprotokoll inte genererar stora mängder högrenade mRNA. Kommersiella kit inkluderar Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) ren mRNA-isolationssats. Dessa grundläggande steg är vanliga för sådana satser:
a) Blanda den RNase-inhiberade lysbufferten som finns i satsen med upp till 300 mikroliter totalt RNA.
b) Värm i 5 minuter vid 65 grader Celsius och sedan omedelbart svalka provet på is i en minut.
c) Blanda detta med 0,5 M natriumklorid och lösa sedan Oligo dT (oligodeoxytymidylsyra) helt i detta prov.
d) Centrifugera detta prov och återvinna supernatanten, som tvättas flera gånger i en serie bindande och lågsaltbuffertar som tillhandahålls i kittorna.
e) Elimera mRNA flera gånger tills en satsspecifik volym (t.ex. 500 mikroliter).
f) Precipitera eluatet med natriumacetat och etanolutfällning. Återupptag i upp till 20 mikroliter av dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlat vatten.
g) Förvara vid -80 grader Celsius och kontrollera efter kvalitet och kvantitet med spektrofotometri.
Tips
Håll alla reagens, celler och RNA kallt genom att nedsänkas i is. Detta hindrar RNA från att försämras av andra enzymer som släpps under homogeniseringsprocessen.
Varning
Reagenser som TRIzol är giftiga och får inte komma i kontakt med hud eller slemhinnor. Observera alltid säkra laboratorieprotokoll vid hantering av detta reagens.
