Celler som observeras på en glid placerad under ett mikroskop räknas med ett gemensamt laboratorieverktyg som kallas en hemacytometer eller en cellräkningskammare i samband med ett uteslutningsfärg, som kallas Trypan Blue. Färgen fläckar döda celler blå men kan inte komma in i levande celler, som kommer att framstå som ljusa vita kuggar genom mikroskopets okular. Forskare behöver räkna celler för att placera det rätta antalet celler i ett cellkulturmedium eller experimentellt reagens för kvantifiering och analys eller helt enkelt för att förhindra att celler växer över.
Bestäm typ av hemacytometer (t.ex. Neubauer) används. Dessa är i grunden tjocka mikroskopskivor som innehåller ett centralt område etsat med räkningsnät. Placera detta under mikroskopet till en låg förstoringsgrad (10-20X) och justera linsens fokus tills dess att invidivala räkningsnät är synliga.
Förbered en cellsuspension. Använd enzymet trypsin att bryta upp vävnaden i enskilda celler och neutralisera sedan trypsinet med serum. Tvätta och pelleta cellerna och resuspendera i media eller saltlösning. Eliminera cellklumpar genom att pipettera försiktigt upp och ner. Om suspensionen förefaller grumlig, späd detta vidare med mer saltlösning.
Använd Trypan Blue för att utesluta döda celler. Överför 10-20 mikroliter cell suspension i ett sterilt rör och blanda med exakt samma volym Trypan Blue färg genom att pipettera försiktigt. Detta später cellsuspensionen 1: 2 i Trypanblå.
Förbered hemaktyometern. Torka med 70% etanol, lufttorka och placera sedan ett täckglas över räknarna. Placera 10 mikroliter cellupphängning i \\ "dräneringen \\" överst på varje galler och låt \\ "dränera \\" dra den under täckglaset. Upprepa för detta andra räkningsnät tills båda har ett jämnt lager av cellsuspension.
Räkna antalet celler med hjälp av manuell räknare. Levande celler kommer att reflektera ljuset och bli glänsande, vita och sfäriska. Celler som är blåa är döda eller skadade och bör inte räknas om inte icke-levande cellnummer krävs. Upprepa för alla 8 räkneverk och ta sedan medeltalet. Till exempel, om 800 celler räknas i 8 rutor, så är medelvärdet per rutnät 100 celler.
Beräkna cellens densitet i originalupphängningen. Applicera medelantalet celler till följande formel: Cellkoncentration = Medeltal celler X 10 000 X utspädningsfaktor (= 2, om utspädning är 1: 2) X volym suspension (i milliliter, justera efter behov för mikroliter osv. ).
Rengör hemacytometern. Tvätta av cellsuspensionen, torka hemacytometern ned med blekmedel och /eller 70% isopropanol eller översvämma med 70% etanol. Låt torka eller torka torrt med en luddfri trasa och kassera alla oönskade celluppslamningar i biohazardbehållare.
Varning
Trypan Blue är en mutagen och fläckar permanent så se till att skyddskläder och handskar bärs innan man fortsätter.
