Rekombinant DNA (deoxiribonukleinsyra är en syntetisk typ av nukleinsyra som skapats genom att länka DNA-sekvenser tillsammans som inte skulle naturligt existera under normala omständigheter och miljöförhållanden. Processen för att göra rekombinant DNA tillverkas av en avancerat förfarande i biologi och genetik som kallas genkloning. Rekombinant DNA sätts i en cell, som sedan producerar ett helt nytt protein och används för att syntetisera läkemedel, antikroppar eller specifika proteiner för forskning.

Introduktion

DNA från en donororganisme eller biologisk källa extraheras först från celler och utsätts sedan för en skärprocess som kallas enzymatisk restriktion. Detta genererar fragment av DNA som innehåller genen eller generna av intresse. Dessa fragment kan då vara "klonas" (dvs infogas) eller fastnar på fragment från mottagarorganismen. De införs därefter i större DNA-molekyler ("plasmider") som placeras i en bakterie och tillåts att multiplicera. Det rekombinanta DNAet utvinns sedan och verifieras.

DNA-isolering

DNA måste först extraheras och renas från andra cellulära molekyler, såsom ribonukleinsyror (RNA), proteiner och strukturer såsom cell membran. För kloningsändamål erhålls DNA från kärnan och är känt som "genomiskt DNA". En vanlig metod för DNA-extraktion är genom ultracentrifugering av cellkomponenter i en densitetsgradient uppbyggd med etidiumbromid i cesiumklorid. Alternativt kan en serie alkaliska och saltbuffertvätskor också användas för att återvinna DNA. När detta är utfällt och rengjort av alla andra oönskade föroreningar kan DNA-skälet skäras i fragment.

Restriktionsenzym Digestion av DNA

Restriktionsenzymer är enzymer som skär upp mycket specifika DNA-sekvenser; De är vana vid att skapa unika DNA-fragment. Denna process säkerställer att inga felaktiga, felaktiga eller oönskade sekvenser genereras och införlivas oavsiktligt i det slutliga rekombinanta DNA, vilket kan resultera i både försöksfel och celldöd. För att generera de önskade DNA-fragmenten används ett specifikt enskilt (eller kombination av) enzym (er) för att skära upp eller smälta DNA. Fragmenten renas sedan genom gelelektrofores, vilken separerar dem från det oönskade DNA. En grovmetod involverar helt enkelt mekanisk skärning, som rippar upp de längre DNA-segmenten till mindre som kan användas för kloning.

DNA Ligation

Ligation är processen att klibba eller sammanfoga donatorn och mottagare (eller vektor) DNA-fragment för att skapa en rekombinant DNA-molekyl. Helst skulle de restriktionsenzymer som valts för att skapa fragmenten ha varit mycket noga genomtänkt och utformad så att de låter dessa bitar sätts samman som ett pussel. För att göra detta föredrages restriktionsenzymer som producerar kompatibla "klibbiga ändar", så att alla kompatibla fragment kommer att naturligt sammanfogas med varandra; annars kan DNA-ligasenzymet användas för att ansluta DNA-segmenten med fosfodiesterbindningar.

Rekombinant DNA-replikation

Processen för transformation eller värmekock användes för att sätta den rekombinanta DNA-molekylen i en värd bakteriecell, som sedan kan generera många kopior av det syntetiska DNA. Dessa bakterier odlas på agarplattor, odlas upp i speciella bakteriebuljonger och lyseras därefter för att frigöra det rekombinanta DNA. Slutligen kan DNA verifieras genom DNA-sekvensering, funktionella experiment och restriktionsenzym digestion.