Molekylkloning är en vanlig bioteknikmetod som varje student och forskare ska känna till. Molekylär kloning med användning av en typ av enzym kallas ett restriktionsenzym för att skära humant DNA i fragment som sedan kan införas i plasmid-DNA i en bakteriecell. Restriktionsenzymer skar dubbelsträngat DNA i hälften. Beroende på restriktionsenzymet kan skärningen resultera i antingen en klibbig ände eller en trubbig ände. Klibbiga ändar är mer användbara vid molekylär kloning eftersom de säkerställer att det humana DNA-fragmentet införs i plasmiden i rätt riktning. Ligeringsprocessen, eller fusion av DNA-fragment, kräver mindre DNA när DNA: n har klibbiga ändar. Slutligen kan flera klibbiga ändrestriktionsenzymer producera samma klibbiga ände, trots att varje enzym känner igen en annan restriktionssekvens. Detta ökar sannolikheten för att din DNA-region av intresse kan skäras ut av klibbiga ändenzymer.
Begränsningsenzymer och restriktionsplatser
Begränsningsenzymer är enzymer som skär känner igen specifika sekvenser på dubbelsträngat DNA och skära DNA i hälften vid den sekvensen. Den igenkända sekvensen kallas restriktionsstället. Restriktionsenzymer kallas endonukleaser eftersom de skär dubbelsträngat DNA, vilket är hur DNA normalt finns vid platser som ligger mellan DNA-ändarna. Det finns mer än 90 olika restriktionsenzymer. Varje erkänner en distinkt begränsningsplats. Restriktionsenzymer klyver sina respektive restriktionsställen 5000 gånger mer effektivt än andra platser som de inte känner igen.
Den högra orienteringen
Begränsningsenzymer finns i två generella klasser. De skär antingen DNA i klibbiga ändar eller trubbiga ändar. En klibbig ände har en kort region av nukleotider, DNA-byggstenarna, som är oparmade. Denna orörda region kallas ett överhäng. Överhänget sägs vara klibbigt eftersom det vill och kommer att para med en annan klibbig ände som har komplementära överhängningssekvens. Klibbiga ändar är som förlorade tvillingar som vill krama varandra tätt när de möts. Å andra sidan är stumma ändar inte klibbiga eftersom alla nukleotiderna redan är parade mellan de två strängarna av DNA. Fördelen med klibbiga ändar är att ett fragment av humant DNA endast kan passa in i en bakteriell plasmid i en riktning. I motsats därtill, om både den mänskliga DNA-och bakterieplasmiden har trubbiga ändar, kan det mänskliga DNA-värdet införas huvud till svans eller svans-till-huvud i plasmiden.
Ligating Sticky Ends kräver mindre DNA
Även om DNA med stickändar har en lättare tid att hitta varandra på grund av deras "klibbighet", kan varken klibbiga ändar eller trubbiga ändar smälta samman i en kontinuerlig bit DNA. Bildandet av en kontinuerlig bit DNA som är helt länkad kräver ett enzym som kallas en ligas. Ligaser förbinder nukleotidernas ryggben vid de klibbiga eller trubbiga ändarna, vilket resulterar i en kontinuerlig kedja av nukleotider. Eftersom klibbiga ändar finner varandra snabbare på grund av deras attraktion för varandra kräver ligeringsprocessen mindre humant DNA och mindre plasmid-DNA. De trubbiga ändarna av DNA och plasmider är mindre benägna att hitta varandra, och därför innebär ligering av trubbiga ändar att mer DNA sätts i provröret.
Olika enzymer kan ge samma klibbiga änden
Restriktionsställen är belägna genom organismernas genom, men är inte jämnt fördelade. I plasmider kan de konstrueras för att vara belägna bredvid varandra. Forskare som vill klippa ut ett fragment av humant DNA från det mänskliga genomet måste hitta restriktionsställen som är framför och bakom fragmentets område. Förutom att säkerställa att ett DNA-fragment införs i rätt riktning kan olika klibbiga ändenzymer skapa samma klibbiga ände trots att de känner igen olika restriktionssekvenser. BamHI, BglII och Sau3A har till exempel olika igenkänningssekvenser men producerar samma GATC-klibbiga ände. Detta ökar sannolikheten för att det kommer att finnas klibbiga ändrestriktionsställen som flankerar din mänskliga gen av intresse.
