Av Palmer Owyoung · Uppdaterad 24 mars 2022
Bakterier odlas på agar i petriskålar och bildar synliga kolonier som representerar grupper av celler. Medan en enkel koloniräkning kan ge en snabb uppskattning av bakteriell belastning, ger kvantitativa metoder som livskraftiga plattantal både absoluta tal och kvalitativa insikter om hur olika förhållanden påverkar tillväxten. Eftersom en enda maträtt kan innehålla miljarder celler måste kulturen först spädas i serie till en nivå där enskilda kolonier kan räknas tillförlitligt.
Börja i ett sterilt 1,5 ml rör. Pipettera 10 µL av startkulturen till 90 µL sterilt spädningsmedium (t.ex. fosfatbuffrad saltlösning). Förslut röret, vortexa försiktigt och du har en utspädning på 10⁻¹. Upprepa överföringen av 10 µL till färskt 90 µL medium för att generera en 10⁻² utspädning och så vidare. Fortsätt tills du når en utspädning mellan 10⁻⁴ och 10⁻¹⁰. Märk varje rör (10-1, 10-2, …) för att hålla reda på utspädningsfaktorn.
Ta 10 µL från det mest utspädda röret som fortfarande ger räknebara kolonier (vanligtvis 30–300 per platta). Sprid inokulumet jämnt över agarytan med en glasspridare, rotera plattan 90° och upprepa. Förbered minst tre plattor per spädning för att säkerställa statistisk konfidens. Låt spridaren torka på en låga eller bänk i några minuter, sätt sedan tillbaka locken och inkubera vid optimal temperatur för organismen (vanligtvis 35–37°C) i 12–16 timmar.
Efter inkubation, inspektera varje platta för ett räknebart antal kolonier. Markera botten av skålen (inte locket) med en permanent markör vid varje kolonis position och räkna ihop prickarna. Välj plattor som innehåller mellan 30 och 300 kolonier för korrekt statistik.
Beräkna kolonibildande enheter (CFU) per milliliter av den ursprungliga kulturen med hjälp av formeln:
CFU/mL = (antal kolonier) × 10×10ⁿ
där n är den negativa exponenten för utspädningsfaktorn (t.ex. för en 10⁻⁷ utspädning, n = 7). Faktorn 10 står för 10 µL ympvolymen.
Sterilisera spridaren i 70 % etanol, tänd den med en bunsenbrännarlåga, låt alkoholen brinna av och kyl den på den torra agarytan. Detta dödar alla kvarvarande mikrober innan plätering.
Hantera alla bakteriekulturer som potentiellt farliga. Följ institutionella riktlinjer för biosäkerhet och använd lämplig personlig skyddsutrustning.
