En forskargrupp från Department of Energy's Oak Ridge National Laboratory har utfört den första undersökningen någonsin i direkt nanoskala av ett levande cellmembran. Genom att göra så, det löste också en långvarig debatt genom att identifiera små grupperingar av lipidmolekyler som sannolikt är nyckeln till cellens funktion.

De utvecklade metoderna ger en ny experimentell plattform för biofysikaliska studier av membran och, potentiellt, andra cellkomponenter. Det kan visa sig användbart för framtida forskning om viktiga interaktioner som läkemedelsmembran, biobränslemembran, och även interaktioner mellan antibiotika och membran.

Det multidisciplinära projektet – ledd av biofysikern John Katsaras, kemisten Bob Standaert och mikrobiologen James Elkins – utfördes vid labbets högflödesisotopreaktor och spallationsneutronkälla med hjälp av bakterien Bacillus subtilis . Teamet publicerade sina resultat i tidskriften PLoS Biologi .

En cells membran är ett tunt dubbelskikt av lipidmolekyler bland vilka finns andra biomolekyler såsom proteiner. Forskare har varit osäkra på om membranlipider ibland organiseras i grupper som kallas domäner, även känd som "flottar, " eller om de är slumpmässigt fördelade i membranet. Organisation av lipider i distinkta domäner inom cellmembranet tros möjliggöra funktioner som signalering mellan celler.

"Det blev en debatt, " sa Katsaras. "Vissa människor trodde att de existerade, medan andra trodde att de inte gjorde det. Det fanns många indicier som kunde stödja båda sidor."

Problemet var att befintliga tekniker inte var kapabla att entydigt lösa denna fråga.

Neutronspridningsanalys var nyckeln till projektets framgång. Lipiddomäner är för små för att kunna ses av optiska mikroskop som använder ljus för att undersöka prover som biologiska celler. Dock, neutroner har ingen sådan begränsning och kan användas för att ge en nanoskalavy av en cell. Dessutom, till skillnad från andra verktyg i nanoskala, neutroner kan användas för att undersöka en levande cell utan att skada den.

Medan neutronspridningsanalys övervann begränsningarna hos andra teknologier, det innebar några egna skrämmande utmaningar. Det första var att utveckla ett experiment där neutroner spreds från lipidmolekyler i membranet utan att interagera med andra komponenter i cellen, som proteiner, RNA, DNA och kolhydrater. Nästa utmaning var att skilja en typ av lipidmolekyl från en annan.

Lösningen på båda dessa utmaningar låg i användningen av deuterium, en isotop av väte vars kärna innehåller en neutron såväl som en proton. Däremot vanliga vätekärnor innehåller en proton men ingen neutron. Medan en biologisk cell själv uppfattar liten skillnad mellan normalt väte och deuterium, de två isotoperna ser väldigt olika ut när man tittar på dem med neutronspridning.

ORNL-teamet skapade en stam av bakterien som innehåller tillräckligt med deuterium för att göra cellstrukturerna i huvudsak osynliga för neutroner. De såg sedan till att lipidmolekylerna i membranet helt och hållet bestod av två fettsyror innehållande specifika proportioner av deuterium och väte.

De introducerade därefter de två typerna av fettsyror med olika isotopförhållanden. Cellmembranet var fritt att skapa och införliva i sitt membran lipidmolekyler från dem, med varje lipidtyp som sedan innehåller en specifik blandning av de två isotoperna. Om lipiderna fördelades slumpmässigt genom membranet, då skulle membranet se enhetligt ut när det exponerades för neutroner, liknar en optisk bakgrund som var mellangrå.

Om, dock, lipiderna samlas med andra av deras typ, bakgrunden skulle upphöra att vara enhetlig och skulle visa motsvarigheten till ljusare och mörkare gråa områden. Detta är faktiskt vad laget hittade. De grå fläckarna som upptäcktes med neutroner mätte mindre än 40 nanometer tvärs över. Själva membranet var cirka 2,4 nanometer tjockt.

ORNL-forskarna betonade att deras tillvägagångssätt att skapa intern kontrast i levande celler med hjälp av isotoper var lovande för annan forskning också, att öppna tekniken för riktad deuteration för andra fysiska tekniker (t.ex. kärnmagnetisk resonansspektroskopi).

"De människor som studerar dessa saker tenderar att använda speciella typer av sonder, " Katsaras noterade. "De använde inte neutronspridning eftersom det inte var i biologens styrhytt. Vår nya experimentella metod öppnar för nya forskningsområden.

"Till exempel, du kan använda de modifierade bakterierna som en plattform för att undersöka antibiotika, eftersom många av dessa antibiotika verkligen talar till membranet."