En illustration visar tjudet som länkar ett ArcLight-proteins fluorescerande domän (grön och grå) till dess spänningsavkännande domän (orange) i en neurons membran. Risforskare föreslår i en ny studie att depolarisering av membranet flyttar den spänningsavkännande domänen, vilket i sin tur komprimerar det fluorescerande proteinet och släcker det. Kredit:Lena Simine
Rice University-forskare har effektivt släckt en debatt om mekanismen bakom en fluorescerande biosensor som övervakar neuroner genom att känna av förändringar i spänningen.
Arbetet ledd av Rice teoretiske kemisten Peter Rossky och postdoktorn Lena Simine bekräftade genom datorsimuleringar deras teori att en mekanisk process kontrollerar släckningen av fluorescens i ArcLight, en syntetisk spänningsindikator placerad i proteiner som kantar de inre membranen av neuroner.
Genom sina modeller, forskarna kopplade både mekanismen och fluorescensen till styrkan hos elektriska fält som de observerade över kromoforen, den fluorescerande delen av proteinet. Deras resultat visade att ett enkelt mått på fältet i en simulering kunde användas för att förutsäga om och hur väl nya fluorescerande sensorer kommer att bete sig innan forskare syntetiserar dem, sa Rossky.
Studien visas i Journal of the American Chemical Society .
ArcLight, utvecklad av Yale neuroforskare Vincent Pieribone 2012, är ett genetiskt kodat fluorescensspänningsindikatorprotein. Den innehåller en mutation som gör att fluorescenssignalen dämpas när spänningen stiger och ljusnar när spänningen faller. Det gör det användbart för att spåra signaler i nervsystemet genom att uttrycka proteinet i neuroner och se hur de lyser.
Proteinet är bunden till neuronens cellvägg av en spänningsavkännande komponent som rör sig några ångström när en signal från en annan neuron ändrar den elektriska laddningen i membranet. Risforskarna teoretiserade att rörelse drar proteinet mot membranet, komprimera den och släcka fluorescens.
Rossky sa att att ändra formen på proteinet för två rester en nanometer närmare varandra. Det räcker för att diktera hur kromoforen gör sig av med energi, antingen som ljus (genom att ge upp fotoner och fluorescerande) eller som värme.
"Vi antog vilken geometriförändring som inträffar i proteinet som ett resultat av membranets respons, " sa Rosssky. "Och sedan frågade vi, "Ändrar detta fluorescensen?" Och vi upptäckte att det gör det. Dessutom, vi visade att övervakning av en mycket enklare kvalitet - det elektriska fältet längs två axlar där fluorescensen kommer ifrån - är tillräckligt för att fullständigt beskriva svaret."
Det naturliga ArcLight-proteinet till vänster, med ankarrester 2,5 nanometer från varandra, fluorescerar när det utlöses av ljus med rätt frekvens. Men fluorescensen stängs av när proteinet komprimeras, vilket för ankarna en nanometer närmare. Risforskare hittade en koppling mellan mekanismen och en elektrisk signal i proteinet som kan användas som markör när man simulerar nya fluorescerande proteiner med datormodeller. Kredit:Lena Simine
ArcLight visade sig vara en bra modell. Pieribone, en Rice-samarbetspartner, berättade för deltagarna vid en föreläsning 2014 på Rice att inte ens han visste exakt hur det fungerade. Föreläsningen inspirerade Simine, som just hade kommit till Rice, att påbörja en studie av mekanismen.
"Jag trodde, "Det låter som ett bra projekt för mig, '" Hon sa.
Att arbeta med forskare i gruppen José Onuchic vid Rice's Center for Theoretical Biological Physics (CTBP) gjorde att Simine, en kemisk fysiker av utbildning, att dra nytta av centrets expertis i att simulera proteiner för testning.
Hon sa att en decennielång debatt mellan forskare misslyckades med att avgöra om mekaniska eller elektriska egenskaper hos proteiner orsakade deras fluorescens. Det visade sig vara lite av båda.
"En färsk artikel gav beräkningsbevis för att det övervägande är elektrostatiskt, och det är lite vettigt eftersom proteinet är väldigt mjukt, ", sa Simine. "Vi tänkte också att de mutationerna fastnar på membranet, och när de gör det, proteinets orientering gör att proteinet kan komprimeras." Hon fann att elektrostatiska förändringar i neuronmembranet utlöste den fysiska förändringen som släcker fluorescens, men lämnade också ett elektriskt spår i proteinet som kunde observeras i simuleringen.
"Vi tänkte lite på det och kom fram till en reaktionskoordinat, " sa hon. "Vi kan ta vilken mutation som helst av sekvensen av detta protein och översätta den till två siffror som är indata för denna modell, de elektrostatiska fälten runt kromoforen. Det är en trevlig, elegant fenomenologisk teori."
Laboratoriet planerar att testa sin teknik på specialsyntetiserade fluorescerande proteiner och matchande simuleringar för att se om deras teori och experiment fortsätter att överensstämma. Om de gör det, de förväntar sig att deras modeller kommer att vara mycket användbara för syntetiska biologer som tillverkar nya klasser av fluorescerande markörer.
"Om du vill veta fluorescensen från en given molekyl, du gör experimentet, " sa Rosssky. "Men om du vill veta varför det fungerar, dessa beräkningar är otroligt värdefulla."
