Den nya metoden för dataanalys från superupplösningsfluorescenskorrelationsmikroskopi har verifierats, bland andra, i experiment som imiterar den biologiska miljön. Forskare observerade små fluorescerande färgämnesmolekyler som fäster och lossnar från/till relativt stora, sfäriska miceller. Kredit:IPC PAS, Grzegorz Krzyzewski
Forskare från Institutet för fysikalisk kemi vid den polska vetenskapsakademin har visat, med hjälp av en mikroskopisk teknik med superupplösning, hur man följer kemiska reaktioner som sker i mycket små volymer. Metoden utvecklades i samarbete med PicoQuant GmbH, och gör det möjligt att observera reaktioner inom enskilda cellulära organeller såsom cellkärnor.
De kemiska mekanismerna som är ansvariga för cellens vitala funktioner döljer fortfarande många hemligheter - först nyligen har forskare haft verktygen att titta direkt på de kemiska fenomen som förekommer i levande celler. Dock, på grund av fortsatta tekniska begränsningar, vetenskapen saknar grundläggande kunskap om jämviktskonstantvärdena för kemiska reaktioner i celler. Med andra ord, forskare vet fortfarande inte hur mycket av en kemikalie som är inblandad i en given cellulär reaktion är i en redan reagerad form och hur mycket som är i en oreagerad form. Dessa utmaningar har övervunnits i den aktuella studien. Forskningssamarbetet har utvecklat och demonstrerat en modifiering av superupplösningsfluorescenskorrelationsspektroskopi.
"Vi har sysslat med kemiska reaktioner i celler under lång tid. T.ex. under 2013, vi bestämde diffusionskoefficienterna för alla proteiner i Escherichia coli-bakterien, tack vare vilket det blev möjligt att bestämma reaktionsfrekvensen som ägde rum med deras deltagande. Här var vi intresserade av en liknande fråga i situationer som involverade låga koncentrationer av reagens, " säger prof. Robert Holyst (IPC PAS). "Biologiska reaktioner är i allmänhet reversibla och, var de förekommer, en viss dynamisk jämvikt skapas vanligtvis mellan mängden reagerade och oreagerade ämnen. I våra försök att bestämma jämviktskonstanter för olika reaktioner i celler, vi tittade på superupplösningsfluorescenskorrelationsspektroskopi. Och här, vi stötte på ett intressant tekniskt problem vars lösning öppnade nya möjligheter för oss i studiet av livets kemi."
Det finns många varianter av mikroskopi, inklusive de som visualiserar enskilda atomer. Dock, när man observerar celler, optisk mikroskopi förblir oslagbar på grund av dess låga invasivitet och förmågan att visualisera den rumsliga strukturen hos levande organismer. Under en lång tid, dess grundläggande nackdel var dess relativt dåliga upplösning - grundläggande fysiska begränsningar (diffraktion) gör det omöjligt att särskilja detaljer som är mindre än cirka 200 nanometer med standardoptiska tekniker.
En typ av optisk mikroskopi är fluorescensmikroskopi. Det innebär att man introducerar ett fluorescerande färgämne på platserna för det biologiska provet som studeras, och sedan skanna provet med en fokuserad laserstråle, som stimulerar färgämnesmolekylerna att glöda. 1994, Stefan W. Hell presenterade en metod för att överskrida diffraktionsgränsen i fluorescensmikroskopi med hjälp av stimulerad emissionsutarmning (STED). STED kräver en extra laserstråle som liknar en munk i tvärsnitt. Denna stråle släcker de yttre områdena av laserstrålens huvudfokus och reducerar följaktligen dess storlek till värden under diffraktionsgränsen. Med superupplösningsmetoder är det nu möjligt att se rumsliga detaljer på endast 10 nm med en tidsupplösning på upp till mikrosekunder.
Vid Institutet för fysikalisk kemi vid den polska vetenskapsakademin i Warszawa, det visades hur man observerar förloppet av kemiska reaktioner i extremt små volymer, jämförbar med storleken på cellkärnor, med hjälp av superupplösningsfluorescenskorrelationsmikroskopi. I bilden, doktoranden Xuzhu Zhang i laboratoriet Kredit:IPC PAS, Grzegorz Krzyzewski
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en ny gren av optisk mikroskopi för att studera molekylers rörelse. I superupplösta varianter, laserns fokus har en volym som mäts i tiotals attoliter (en attoliter är en miljarddels miljarddels liter). Mätningen innebär att mäta ljuset som emitteras av ett fluorescerande färgämne fäst till den testade molekylen exciterad av en laserstråle. Att känna till storleken på fokus och varaktigheten av fluorescens, och med hjälp av lämpliga teoretiska modeller, det är möjligt att bestämma hastigheten för även enskilda molekyler.
"För en tid, det har varit känt att medan superupplösning FCS-mikroskopi fungerar bra när man observerar molekyler som rör sig i två dimensioner, t.ex. i lipidmembran, det misslyckas i observationer i volymer. Diffusionstider, bestäms på basis av mätningar i 3D, kan skilja sig från förutsägelserna från mätningar i 2-D med en storleksordning eller till och med mer. Efter några månaders forskning, det blev tydligt för oss att dessa avvikelser berodde på det överdrivet förenklade sättet att bestämma fokusets rumsliga storlek, " säger Dr Krzysztof Sozanski (IPC PAS).
På grundval av sina egna teoretiska analyser och erfarenheter, forskarna i Warszawa konstruerade en ny, universell teoretisk modell som introducerar en korrigering av fokusets rumsliga form och tar hänsyn till dess inverkan på det uppmätta signal-brusförhållandet. Modellens riktighet verifierades initialt i mätningar av diffusionshastigheten för olika fluorescerande prober i lösningar.
"Vi genomförde också mer avancerade experiment. T.ex. vi studerade en reversibel reaktion där färgämnesmolekylerna fäste sig vid miceller och sedan lossnade efter en tid. Systemet, består av relativt stora kulor av ytaktiva molekyler som reagerar med färgämnesmolekylerna, reflekterade förhållanden som är karakteristiska för biologiska strukturer, " säger doktoranden Xuzhu Zhang (IPC PAS). Mätningarna var inte enkla. Om molekylerna i båda reaktanterna rörde sig långsamt, när färgen passerade genom fokuset kunde färgämnet upprepade gånger smälta samman/kopplas från/från micellerna och medelvärdet av det emitterade ljuset skulle beräknas.
Men det kan också finnas en variant av den andra ytterligheten:kopplings- och urkopplingsreaktionerna kunde gå så långsamt att det under övergången genom fokus inte skulle ske någon förändring i förhållandet mellan reagenserna – då skulle det inte bli någon medelvärde. "Vår modell tar inte bara hänsyn till båda extremfallen, men också alla mellanliggande. Och med kunskapen till vårt förfogande om den faktiska storleken på fokus, vi kan ändra dess storlek och experimentellt undersöka alla fall som modellen kräver både i samma kemiska system och på samma utrustning, " betonar Zhang.
En viktig egenskap hos den analysmetod som utvecklats vid IPC PAS är det faktum att inga ändringar i apparatur behövs för dess tillämpning. Efter lämplig anpassning, metoden kan användas för att mer exakt tolka data som registrerats av FCS-färdiga STED-mikroskop som redan är i produktion.
