En del av forskargruppen som upptäckte specifika regioner på enzymer som hjälper till att bryta ner cellulosa snabbare, NREL-forskaren Markus Alahuhta förbereder plattor för att erhålla proteinkristaller för strukturell bestämning. Kredit:Dennis Schroeder / NREL
Det var mer än 10 år på väg, men när det gällde att avslöja hemligheterna bakom enzymernas molekylära struktur, uthållighet lönade sig. Genom att studera och jämföra arbetshästens cellulosanedbrytande enzymer hos två svampar, forskare från Energy Department's National Renewable Energy Laboratory (NREL) har pekat ut regioner på dessa enzymer som kan riktas mot genom genteknik för att hjälpa till att bryta ner cellulosa snabbare.
Nyligen publicerad i Naturkommunikation , "Engineering enhanced cellobiohydrolase activity" beskriver NREL:s långvariga studie av svampcellobiohydrolaser (CBH) - enzymer som använder hydrolys som sin huvudsakliga kemi för att bryta ner cellulosa - Trichoderma reesei (TrCel7A) och Penicillium funiculosum (PfCel7A). År av noggrann forskning har gett stora belöningar:teamet har fått en bättre förståelse för struktur-aktivitetsrelationerna för dessa enzymer för att förutsäga de bästa platserna att göra förändringar och förbättringar.
I både natur och industriella processer, enzymer från denna familj är bland de viktigaste enzymerna för att bryta ner cellulosa. En beräknad 2, 000 ton per dag cellulosaetanolfabrik kan potentiellt använda upp till 5, 000 ton enzym per år, och hälften av den enzymcocktailen kan komma från denna enzymfamilj. "Det har varit en drivkraft under de senaste decennierna av att försöka förstå och förbättra biokatalysatorer från denna nyckelenzymfamilj, sa Gregg Beckham, gruppledare vid NREL och senior författare till studien. "Ju effektivare enzymet är, ju mindre enzym som används, och därmed är processen billigare. Dock, vi har fortfarande en lång väg kvar att gå för att kunna göra förbättringar i en prediktiv kapacitet."
Sedan, under 2005, NREL-forskarna Mike Himmel, Steve Decker, och Bill Adney upptäckte en CBH från en annan svamp, PfCel7A, och fann att den presterar 60 procent bättre än TrCel7A. "Det förvånade oss att detta enzym var så mycket bättre än industristandarden, sa Decker, som ledde uppgiften efter att Adney lämnade NREL. "Vi körde många experiment under de senaste åren för att vara säkra på att aktiviteten var verklig. Sedan, självklart, vi ville veta varför det var bättre."
"Om vi kunde förstå de strukturella skillnaderna, då skulle vi potentiellt kunna använda den informationen för att konstruera bättre enzymer, vilket i sin tur kan bidra till att minska kostnaderna för cellulosahaltigt biobränsle och biokemisk produktion, ", sa Beckham. "Med tanke på utmaningen att arbeta med dessa enzymer, det tog NRELs team sju år av grundligt experimentellt arbete för att utveckla de verktyg som behövs för att säkerställa att det finns ett par hot spots på dessa två CBH som kan modifieras för att få dem att prestera bättre."
Enligt Decker, "Just då, verktyg för genteknik i Trichoderma var mycket begränsade, men vi visste från tidigare arbete att andra värdar hade problem med att uttrycka dessa proteiner. Vi började i princip från början och byggde vårt eget interna T. reesei-system av värdstammar, vektorer, och transformations- och screeningprotokoll. Jämfört med välutvecklade system som E. coli, T. reeseis dåliga transformationseffektivitet, tråkiga urvalsprocesser, långsam tillväxt, och lågt proteinutbyte gjorde detta till en utmanande operation. Varje stam vi byggde tog månader från design till slutlig testning."
Upptäckten utvecklades när NREL tog en närmare titt på likheterna mellan TrCel7A och PfCel7A och arbetade sedan för att isolera skillnaderna. Båda enzymerna har en arkitektur med tre domäner:den kolhydratbindande molekylen som binder den till cellulosa; den katalytiska domänen som bryter ner cellulosa; och länken som kopplar samman dessa två domäner. Forskargruppen genomförde sedan domänbyteexperiment genom att skapa ett chimärbibliotek, som är en samling muterade enzymer skapade av de två moderenzymerna.
"Med tre domäner mellan två föräldrar, som gör åtta kombinationer totalt, ", sa Beckham. "Vi testade de olika kombinationerna för att ta reda på vilket område som ger enzymet bättre prestanda, och kanske inte överraskande, i efterhand, det är den katalytiska domänen."
Med dessa fynd, forskarna jämförde sedan de katalytiska domänerna i TrCel7A och PfCel7A och fann åtta områden som var olika. Fortsätter att begränsa möjligheterna, laget tog TrCel7A-föräldern och gjorde ändringar, en i taget, i dessa åtta områden och avslöjade två viktiga modifieringar som resulterade i att TrCel7A presterade nästan till PfCel7A-förälderns nivå.
"Dom där två, mycket små förändringar på detta enorma protein fördubblade i princip prestandan hos TrCel7A, ", sa Beckham. "Vad detta lär forskare som gör proteinteknik på dessa otroligt utmanande enzymer är att det finns mycket små förändringar i denna katalytiska domän som kan modifieras för att dramatiskt påverka enzymets prestanda, vilket gör det kapabelt att bryta ner cellulosa snabbare och därmed tillåta industriella processer att använda mindre enzym."
"Vi visste att upptäckten av PfCel7A var viktig vid den tiden, men vägen framåt var inte helt klar, sa Himmel, den övergripande projektledaren. "Vi tacklade den svåraste familjen av cellulaser att förbättra först, och så följer att biomassanedbrytande enzymer från andra familjer kan göras maximalt aktiva i en mer strömlinjeformad process, med mindre forskning och utveckling. Det var sammansmältningen av experimentell biokemi och beräkningsvetenskap som förde denna studie till Naturkommunikation och det resultatet var endast möjligt med ihållande finansiering från Bioenergy Technologies Office."
NREL-teamets slutmål är att hjälpa andra forskare att sålla genom berget av genomikdata för att hitta bättre enzymer, enbart baserat på deras genetiska sekvens. "Om 10 år, det skulle vara så spännande att kunna sitta ner med tusentals enzymsekvenser från denna familj och kunna förutsäga vilka få man ska prova, ", sa Beckham. "Denna studie är ett steg på en mycket lång väg, men det är ett värdigt mål."