Gensignalförstärkaren som utvecklats av biovetare vid Rice University utmärker sig när det gäller att detektera uttrycket av målgener och kan också användas för att detektera potentiellt vilken cellulär gen som helst. Förstärkaren är kopplad till en cells kromosom och rapporterar direkt om aktiviteten hos en gen genom att uttrycka fluorescerande proteiner (GFP). När genen inte är aktiv, förstärkaren uttrycker negativa regulatorer som släcker GFP genom att arbeta på olika hierarkiska nivåer av cellulärt informationsflöde. EKRAB är en transkriptionell repressor och NanoDeg är en post-translationell regulator. När genen är aktiv, tTA producerar GFP och blockerar uttrycket av de negativa regulatorerna. Kredit:Segatori Research Group/Rice University
Ett nytt system för att förstärka genuttryckssignaler skulle kunna vara en spelomvandlare för forskare som studerar de reglerande processerna i celler som är centrala för allt liv.
Rice University lab av biovetare Laura Segatori har utvecklat en mångsidig gen -signalförstärkare som kan göra ett bättre jobb med att upptäcka uttryck av målgener än nuvarande metoder.
I sista hand, forskarna hoppas att tvåmodulssystemet kommer att förenkla diagnosen av sjukdomar som Alzheimers, diabetes och vissa cancerformer som kännetecknas av distinkta mönster av proteinuttryck. De sa att det också kan möjliggöra cellbaserade terapier genom vilka sjuka celler kan göra sin egen medicin vid behov.
Deras arbete beskrivs i Natur kemisk biologi .
Den första modulen är en del av en sträng syntetisk genetisk kod som läggs till DNA i en däggdjurscell via CRISPR-Cas9-redigering. En gång integrerad intill en målgen, koden möjliggör en genetisk krets som övervakar genen och, när genen producerar ett protein, kretsen avger också ett grönt fluorescerande protein (GFP). Kretsen är designad för att förstärka GFP-signalen och möjliggöra detektion av mycket små förändringar i målgenen som inte alltid är möjliga med nuvarande verktyg.
När genen är inaktiv, den andra modulen baserad på en antikropp som först hittades i kameler stoppar produktionen av det fluorescerande proteinet och bryter ner eventuella GFP:er i närheten. Kombinationen ger forskarna en stark "on-off"-signal som också är känslig för dynamiken i uttrycket av målgenen. När genuttrycket ökar, kretsen aktiverar uttryck av GFP och hämmar samtidigt uttryck för negativa regulatorer av GFP, som nanobody.
"Att kunna övervaka genuttryck med hög känslighet är verkligen viktigt för en mängd olika biomedicinska tillämpningar, "Segatori sa." Det är viktigt att ha ett detektionssystem som är känsligt för även små förändringar i genuttryck, som ofta är biologiskt relevanta. Det är också avgörande för ett detekteringssystem som ger bra dynamisk upplösning så att vi kan följa dynamiken i genuttryck, som vanligtvis är en avgörande faktor för cellbeteende.
"Det är vad vår gensignalförstärkare i huvudsak gör, "sa hon." Vi utvecklade en genetisk krets som, för det första, vi kan länka till vilken gen som helst i kromosomen, på så sätt genererar ett verktyg som rekapitulerar det kromosomala sammanhanget med all tillhörande komplexitet av reglering. Vi har ingen typ av extrakromosomala reportrar. Detta tillvägagångssätt ger ett känsligt sätt att övervaka alla reglerande och epigenetiska mekanismer som reglerar genuttryck.
"Sedan utvecklade vi en metod för att förstärka signalen så att vi kan övervaka riktigt små förändringar i uttryck, "sa hon." Den är mycket robust och stabil och har hög dynamisk upplösning. "
Systemet kan anpassas för att eventuellt övervaka vilken cellgen som helst, Segatori sa. "Vi kan skapa multiplexreportersystem för övervakning av grupper av gener som är relevanta för utvecklingen av en viss sjukdom eller som ger en omfattande avläsning för en viss signalväg eller fenotyp, " Hon sa.
Teamet demonstrerade metoden på en mängd olika celler och genererade en multiplexreporter för att övervaka markörer associerade med tre signalvägar som svarar på stress i en däggdjurscells endoplasmatiska retikulum. De fann att kretsen förbättrade den fluorescerande signalen tillräckligt för att upptäcka även små förändringar i uttryck.
Den andra modulen, en NanoDeg -krets som introducerades av Rice lab 2017, är en efter-översättningskontroll som ger systemet sitt breda dynamiska omfång, sa Segatori. "Under basala förhållanden, kretsen uttrycker inte bara en transkriptionell regulator som hämmar uttryck av GFP utan också NanoDeg -molekyler som bryter ned eventuell GFP som finns i systemet, så cellen blir helt mörk, "sa hon." Och vi kan ställa in systemet för att anpassa det till detektering av gener med olika basala uttryck genom att använda lämpliga doser av inducerare av kretskomponenterna. "
Experiment bekräftade att integrering av systemet i cellens kromosom inte påverkar uttrycket av målgener.
Som en del av studien, labbet utvecklade också en matematisk modell som forskare kan använda för att anpassa förstärkarplattformen för att övervaka alla målgener och förutsäga de optimala doserna av småmolekylära inducerare som används för att reglera genuttryck.
Segatori och hennes team arbetar för att förbättra plattformen, främst utvecklad av Rice doktorand och huvudförfattare Carlos Origel Marmolejo, att behandla sjukdom.
"Det finns ett stort intresse för närvarande för att utveckla cellterapier som reagerar på feedback, "Segatori sa. "Vår plattform kan tillåta produktion av terapeutika som svar på upptäckt av genuttryckssignaturer som är relevanta för en viss sjukdom eller miljötillstånd."
